Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: chất phân cực sẽ tan trong dung môi phân cực và ngược lại. Tạp chất tan trong dung môi rửa mà không hòa tan chất cần phân lập, cần thiết phải lựa chọn dung môi phù hợp với độ phân cực và độ tan của chất trước khi tiến hành lọc rửa.
2.2.3. Kết tinh
Phương pháp kết tinh dựa trên sự khác nhau rõ rệt về độ tan của các chất trong một dung môi (hay hỗn hợp các dung môi) ở các nhiệt độ khác nhau, hoặc có sự khác nhau về độ tan giữa chất chính và tạp chất ở cùng một nhiệt độ. Dung môi hoặc hệ dung môi được lựa chọn để phù hợp kết tinh với từng chất.
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường 230-240 mesh (Merck) với hệ dung môi giải ly khác nhau phù hợp với từng chất.
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Dữ liệu sắc ký lỏng cao hiệu năng cao được bổ sung cho một hợp chất có hoạt tính sinh học tốt như 5MM, 53H, BPM, PPM, 3TF: sử dụng hệ máy HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies, CA, USA), đầu dò DAD ở bước sóng 254 nm, dữ liệu được ghi nhận bởi phần mềm Agilent Chemstation 4.0. Sử dụng cột C18 pha đảo Zorbax SB-C18 (Agilent Technologies, CA, USA) với thông số cột 4.6 mm×250 mm, kích thước hạt 5 μm. Thực hiện phân tích ở 26 °C, tốc độ dòng 0,8 mL/phút trong suốt quá trình chạy. Dung môi rửa giải A: nước cất chứa 0,1% formic acid và B: 100% acetonitrile. Điều kiện chạy như sau:
Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%) 0 70 30 20 30 70 21 0 100 27 0 100
2.2.5. Đo điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy được đo trên máy Electrothermal 9100 (UK), dùng mao quản, không hiệu chỉnh tại Viện Công nghệ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6. Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR Bruker Equinox 55, với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 400 cm-1, tại Viện Công nghệ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.7. Phương pháp khối phổ phân giải cao (HRMS)
Khối phổ phân giải cao (dùng kĩ thuật ESI: electrospray ionization) được ghi trên hệ thống máy X500R QTOF (Sciex) tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Tp.HCM.
2.2.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker Advance AV500 MHz và Bruker DRX 500, tần số 500 MHz với phổ 1H-NMR và 125 MHz đối với phổ 13C-NMR, tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuấtbenzimidazole và indole benzimidazole và indole
Ba dòng tế bào ung thư trên người sử dụng trong nghiên cứu: A549 (ung thư phổi), MDA-MB-231 (ung thư vú), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt) được cung cấp bởi giáo sư Jeong-Hyung Lee – Khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Kangwon – Hàn Quốc. Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư được thực hiện tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thử nghiệm gây độc dòng tế bào HEK 293 (tế bào thận gốc phôi ở người) – có nguồn gốc từ Ngân hàng Tế bào Hoa Kỳ ATCC – được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1. Nguyên tắc xác định
Các dẫn xuất tổng hợp benzimidazole và indole được đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) trên các dòng tế bào ung thư ở người: ung thư phổi A549, ung thư vú MDA-MB-231, ung thư tuyến tiền liệt PC3, sử dụng chứng dương là camptothecin. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ty thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzyme succinate dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống, MTT (màu vàng) biến đổi thành các tinh thể formazan (màu tím) (sơ đồ 2.5). Số lượng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang OD của dung dịch đo ở 570 nm [121]. Độ hấp thụ được đo trên hệ máy ELISA Bio-Rad (Mỹ) tại Trung tâm tiên tiến về hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Muối tetrazolium MTT (màu vàng) Formazan (màu tím)
2.3.2. Cách tiến hành
Các tế bào ung thư được nuôi cấy in vitro theo phương pháp của Tim Mosmann và cộng sự [122]. Tế bào được nuôi cấy 48h trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37 oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 unit/mL) và streptomycin (100µg/mL). Sau đó chúng được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với thể tích là 200 µl, mật độ 2-5x105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào). Sau 24h, chúng được thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Sau 72h, cho phản ứng với 0,5 mg/µL MTT, ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Camptothecin (CPT) được sử dụng làm chứng dương. 2.3.3. Đánh giá kết quả OD (mẫu thử) – OD ( ngày 0) % = [ �� OD (DMSO) – OD ( ngày 0) × 100] ± ��
Trong đó: CS% (Cell Survival%): tỉ lệ sống sót của tế bào; OD: mật độ quang; SD (Standard Deviation): độ lệch tiêu chuẩn, được tính bằng công thức bên dưới.
√(∑ �� − ��)2 =
�� � − 1
Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i; ��: giá trị OD trung bình; n: số giếng thử lặp lại Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± SD) sẽ được chọn ra cho bước thử nghiệm tiếp theo.
2.4. Xây dựng mô hình docking phân tử
Các phần mềm và thiết bị sử dụng trong quá trình docking được liệt kê chi tiết ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Các phần mềm và thiết bị sử dụng trong quá trình docking
Phần mềm Mục đích sử dụng Thương
mại
ChemDraw 19.1 [123] Xây dựng cấu trúc 2D X
MOE 2015.10 [124] Chuyển đổi cấu trúc 2D sang 3D, và tối ưu hóa cấu trúc 3D của các hợp chất (tối thiểu hóa năng lượng).
Bước 1 Bước 2 Bước 3 Bước 4
Đánh giá kết quả từ mô hình Docking các ligand với mục tiêu tác động
Docking lặp lại (Re-docking) Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Chuẩn bị và tối ưu hóa cấu trúc protein cho quá trình docking.
Sybyl-X 1.1 [125] Mô phỏng động lực học phân tử của các hợp chất để chọn ra được cấu trúc có năng lượng tối thiểu toàn phần
X
BiosolveIT LeadIT 2.1.8 [126]
Docking phân tử X
Discovery Studio Visualizer 4.0 [127]
Phân tích tương tác và trình bày cấu trúc sau khi docking
Thiết bị
Tất cả các quá trình xây dựng mô hình docking được thực hiện trên hệ thống máy vi tính có cấu hình Intel(R) Core(TM) i3-9100F CPU @ 3,60GHz, 8GB RAM, Visual Graphic Card: NVIDIA GeForce GTX 1650 4GB và trên hệ điều hành 64 bit Windows
10 (Microsoft, Redmond, WA, USA)
Quy trình xây dựng mô hình docking gồm các bước sau:
2.4.1. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu
Các cấu tử được vẽ công thức cấu tạo bởi chương trình ChemDraw Ultra 19.1. Tiếp tục được tối ưu hoá năng lượng bằng chương trình MOE 2015.10. Tối ưu hóa năng lượng lần 2 được thực hiện bởi chương trình Sybyl-X 1.1 nhằm đưa ra được cấu dạng có năng lượng tối thiểu trong toàn bộ các cấu dạng được tạo ra. Vì các cấu dạng ban đầu được vẽ bằng phần mềm ChemDraw nên độ dài các liên kết, vị trí các nguyên
tử, góc liên kết có thể không phù hợp với thực tế. Do đó việc tối ưu hóa năng lượng sẽ quay lại các góc liên kết, đặt lại vị trí các nguyên tử, điều chỉnh độ dài các liên kết nhằm tạo ra cấu dạng có năng lượng tối thiểu. Cấu dạng có năng lượng tối thiểu thường bền hơn các cấu dạng có năng lượng cao hơn. Việc chọn lựa cấu dạng có năng lượng tối thiểu nhằm nâng cao khả năng tương thích giữa kết quả docking và khả năng thể hiện hoạt tính thực tế của cấu tử.
2.5.1.1. Chuẩn bị cấu trúc protein
Cấu trúc protein được chuẩn bị trong MOE 2015.10 bằng công cụ Sequence Editor và QuickPrep. Phức hợp protein được sử dụng trong nghiên cứu docking đối với các dẫn xuất benzimidazole là phức hợp enzyme topoisomerase I (TopI) DNA của người với CPT và cộng hóa trị với một chuỗi DNA xoắn kép, được tải về từ ngân hàng protein (RCSB Protein Data Bank), ký hiệu là 1T8I. Nước kết tinh (HOH) và ion (Na+, Cl-…) trong dung môi cũng sẽ được xoá bỏ. Hình 2.4 cho thấy ligand đồng kết tinh tương tác tốt với cấu trúc khoang gắn kết được tạo ra để tiến hành docking.
Hình 2.4. Cấu trúc khoang gắn kết của phức hợp TopI và chuỗi DNA xoắn kép với
ligand CPT
2.5.1.2. Chuẩn bị cấu trúc ligand
Cấu trúc 2D của các ligand được chuẩn bị bằng phần mềm Chemdraw 19.1 và lưu file có định dạng *.mol2 để tiến hành bước xử lý tối ưu thiểu hóa năng lượng trong Sybyl-X 2.0. Các bước chuẩn bị trong Sybyl-X 2.0 bao gồm tối thiểu hóa năng lượng lần 1, chạy động lực học, sau đó tối thiểu hóa năng lượng lần 2. Các thông số tối thiểu hóa năng lượng cho cả lần 1 và 2 được thiết lập như sau:
- Method (phương pháp): Conj Grad (Gradient liên hợp)
- Termination → Enery Change: 0,0001 kcal/mol
- Mã Iterations (số bước lặp lại): 10.000
- Modify → Charge (Trường lực): Gasteiger-Huckel
- Các thông số khác được để mặc định.
Động lực học phân tử được tiến hành bằng công cụ Compute → Dynamics →
Setup Simulated Annealing. Thông số Run = 5 và các thông số khác mặc định. Quá
trình động học mô phỏng này có tác dụng giúp phân tử vượt qua trạng thái năng lượng tối thiểu cục bộ. Sau đó, nhờ lần tối thiểu hóa năng lượng thứ 2 để tìm ra trạng thái năng lượng tối thiểu toàn phần của phân tử đó.
Sau khi thực hiện bước chuẩn bị này, các ligand sẽ được lưu thành một tập dữ liệu chung định dạng *.sdf để phần mềm LeadIT 2.1.8 [126] có thể đọc được và thực hiện docking.
2.4.2. Docking lặp lại (re-docking)
Để đánh giá các thông số docking, cách xử lý protein và ligand có phù hợp hay không, quá trình docking lặp lại (re-docking) được tiến hành, phân tử hợp chất (ligand) có sẵn trong cấu trúc tinh thể phức hợp được trích xuất ra docking lặp lại vào khoang gắn kết. Các bước tiến hành re-docking như sau:
- Ligand đồng kết tinh được xuất ra và lưu lại dưới dạng *.mol2 (ví dụ: tên Ligand_export.mol2.)
- Vẽ ligand đồng kết tinh và xử lý bằng Sybyl-X 1.1 (như bước 2.5.1.2), lưu lại dưới dạng *.mol2, đặt tên Ligand_ve.mol2.
- Ligand đồng kết tinh được xử lý tương tự với ligand vẽ, lưu lại dưới dạng *.mol2, đặt tên Ligand_xu-ly.mol2.
- Tập hợp ba ligand lại thành một tập dữ liệu, lưu lại dưới dạng *.sdf.
- Tiến hành re-doking với phần mềm LeadIT với các bước tiến hành được miêu tả như bước 1.4.3., sau đó xác định giá trị RMSD (căn bậc hai của bình phương độ lệch trung bình của cấu dạng ligand sau docking so với cấu dạng có sẵn trong cấu trúc tinh thể). Kết quả re-docking đáng tin cậy khi RMSD ≤ 2 Å, đồng thời so sánh các tương tác trong cấu trúc tinh thể với các tương tác tạo ra sau docking có giống nhau hay không.
2.4.3. Docking các ligand với mục tiêu tác động và đánh giá kết quả
Khi khoang gắn kết đã được xây dựng, tiến hành docking bằng Docking →
Define FlexX Docking → Docking Library → Load File. Các thông số sử
dụng khi docking là:
- Number of Poses to Keep (số cấu dạng có chỉ số docking âm nhất được giữ
lại): Top10 (10)
- Docking Library: thư viện ligand được sử dụng.
- Maximum Number of Solutions per Iteration (số lần lặp lại tối đa): 1.000.
- Maximum Number of Solutions per Fragmentation (số lần phân mảnh tối đa):
200.
Chọn Apply & Dock! để bắt đầu docking.
Kết quả sau khi docking được lưu dưới dạng tệp *.sdf bằng đường dẫn Docking → Export Poses. Toàn bộ quá trình docking cũng được lưu lại bằng đường dẫn
LeadIT → Save Project As, định dạng *.fxx.
Kết quả tương tác giữa cấu dạng docking của các ligand với vị trí gắn kết của CPT trong phức hợp TopI-DNA được hiển thị và phân tích bằng phần mềm Discovery Studio Visualizer 4.0 và MOE 2015.10. Các tương tác này bao gồm: liên kết hydro, tương tác π-π, tương tác van der Waals, các tương tác cation-π, các tương tác ion.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole và indole
3.1.1. Tổng hợp các dẫn xuất benzimidazole
Bảng 3.1. Cấu trúc và hiệu suất tổng hợp của các dẫn xuất benzimidazole tổng hợp
Số thứ tự Tên dẫn xuất X Y Z R1 R2 R3 R4 Hiệu suất* (%) 1 12H H H - OH H H H 73 2 13H H H - H OH H H 81 3 14H H H - H H OH H 91 4 1MM H H - H H OCH3 H 81 5 1DM H H - OCH3 H H OCH3 74
6 1TM H H - H OCH3 OCH3 OCH3 73
7 1DA H H - H H N(CH3)2 H 97 8 12N H H - NO2 H H H 73 9 1TF H H - CF3 H H H 82 10 1IV H H - H OCH3 OH I 97 11 1BO H H - H H O-CH2-Ph H 77 12 1BA H H - H H H H 97 13 22H H CH3 - OH H H H 96 14 23H H CH3 - H OH H H 98 15 24H H CH3 - H H OH H 89 16 2MM H CH3 - H H OCH3 H 89 17 2DM H CH3 - OCH3 H H OCH3 83
18 2TM H CH3 - H OCH3 OCH3 OCH3 93
19 2DA H CH3 - H H N(CH3)2 H 97 20 22N H CH3 - NO2 H H H 88 21 2TF H CH3 - CF3 H H H 90 22 2IV H CH3 - H OCH3 OH I 98 23 2BO H CH3 - H H O-CH2-Ph H 95 24 32H H Cl - OH H H H 68 25 33H H Cl - H OH H H 54 26 34H H Cl - H H OH H 41 27 3MM H Cl - H H OCH3 H 63 28 3DM H Cl - OCH3 H H OCH3 84
29 3TM H Cl - H OCH3 OCH3 OCH3 81 30 3DA H Cl - H H N(CH3)2 H 81 31 32N H Cl - NO2 H H H 67 32 3TF H Cl - CF3 H H H 83 33 3IV H Cl - H OCH3 OH I 98 34 3BO H Cl - H H O-CH2-Ph H 48 35 42H Cl Cl - OH H H H 85 36 43H Cl Cl - H OH H H 78 37 44H Cl Cl - H H OH H 78 38 4MM Cl Cl - H H OCH3 H 87 39 4DM Cl Cl - OCH3 H H OCH3 82
40 4TM Cl Cl - H OCH3 OCH3 OCH3 90
41 4DA Cl Cl - H H N(CH3)2 H 73 42 42N Cl Cl - NO2 H H H 32 43 4TF Cl Cl - CF3 H H H 52 44 4IV Cl Cl - H OCH3 OH I 85 45 4BO Cl Cl - H H O-CH2-Ph H 68 46 52H H Ph-CO - OH H H H 75 47 53H H Ph-CO - H OH H H 78 48 54H H Ph-CO - H H OH H 84 49 5MM H Ph-CO - H H OCH3 H 84
50 5TM H Ph-CO - H OCH3 OCH3 OCH3 83
51 5DA H Ph-CO - H H N(CH3)2 H 98
52 52N H Ph-CO - NO2 H H H 54
53 5TF H Ph-CO - CF3 H H H 53
54 5IV H Ph-CO - H OCH3 OH I 98
55 5BO H Ph-CO - H H O-CH2-Ph H 76
56 62H H - Ph- CH(OH) OH H H H 42
57 63H H - Ph- CH(OH) H OH H H 56
58 64H H - Ph- CH(OH) H H OH H 38
59 6MM H - Ph- CH(OH) H H OCH3 H 71
60 6TM H - Ph- CH(OH) H OCH3 OCH3 OCH3 76
61 6DA H - Ph- CH(OH) H H N(CH3)2 H 63
62 6TF H - Ph- CH(OH) CF3 H H H 28
63 6IV H - Ph- CH(OH) H OCH3 OH I 96
64 6BO H - Ph- CH(OH) H H O-CH2-Ph H 43
(*) Hiệu suất toàn phần
Kết quả tổng hợp 64 dẫn xuất benzimidazole được trình bày ở bảng 3.1. Ở giai đoạn đầu tiên các dẫn xuất o-phenylenediamine được cho ngưng tụ với một loạt các
benzaldehyde chứa các nhóm thế khác nhau (OH, OCH3, NO2, N(CH3)2, CF3, I, O- CH2-Ph) ở điều kiện êm dịu, sử dụng hỗn hợp dung môi ethanol và nước (tỉ lệ 9:1) và chất oxy hóa Na2S2O5, với hiệu suất từ 32% đến 98%. Na2S2O5 là một muối vô