Vật liệu nuôi cấy là các cụm phôi vô tính sơ cấp (hình thành từ mảnh lá) Môi trường nhân phôi được sử dụng từ kết quả của thí nghiệm tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá về môi trường khoáng, loại auxin, nồng độ BA Loại auxin này được sử dụng với các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/L), 30 g/L sucrose Thí nghiệm được bố trí trên các đĩa petri, theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên Cấy 5 cụm phôi/đĩa (3 phôi/cụm), 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thu thập số liệu về số phôi/cụm phôi, hệ số nhân phôi, quan sát đặc điểm hình thái phôi, cụm phôi ở 30 NSC Chú ý quan sát sự hình thành phôi thứ cấp ở các bộ phận (từ thân, lá, rễ) của phôi sơ cấp
2 4 2 Nhân phôi trong môi trường lỏng
2 4 2 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp quanuôi lỏng lắc nuôi lỏng lắc
Sử dụng kết quả của thí nghiệm trên làm cơ sở cho thí nghiệm khảo sát tác động của các chất ĐHST đến sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường lỏng Do đó, môi trường nuôi cấy được kế thừa về môi trường khoáng, các mức nồng độ của loại auxin có phát sinh phôi tích cực và nồng độ BA; nuôi cấy lỏng lắc Sử dụng máy lắc hiệu SARTORIUS của Đức, thực hiện nuôi lỏng lắc với 80 vòng/phút
Vật liệu nuôi cấy là các phôi đơn 60 ngày tuổi (từ thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá)
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác V250 mL, chứa 60 mL môi trường nuôi cấy, nuôi lỏng lắc 80 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 30 phôi/bình Quan sát, theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái và màu sắc phôi ở 30 NSC
2 4 2 2 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khốiphôi phôi
Vật liệu nuôi cấy: sử dụng phôi qua nuôi cấy lỏng lắc sau 60 ngày nuôi cấy từ phôi 60 ngày tuổi của các thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
Để khảo sát ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, sử dụng khối lượng phôi ban đầu như sau: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi cấy kế thừa thí nghiệm ảnh hưởng chất ĐHST, 30 g/L đường Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái phôi/cụm phôi ở 30 NSC
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi
2 4 2 3 Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp
Sử dụng vật liệu là các phôi vô tính với các kích thước khác nhau: kích thước nhỏ (7 - 8 mm), trung bình (~ 10 mm), to (~ 15 mm) Tiến hành cấy 30 phôi nhỏ/trung bình/to vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi cấy giống thí
nghiệm ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy, có 30 g/L đường
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi hình thành ở 30 NSC
2 4 2 4 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phôi 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường như thí nghiệm trên, sucrose được khảo sát với các mức nồng độ (20, 30, 40, 50 g/L); mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi ở 45 NSC Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2 4 2 5 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phôi 0,30 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường như trên, 30 g/L sucrose, nuôi ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: tối (0 lux), chiếu sáng với cường độ 2 000 lux (~ 27 μmol m-2 s-1), 4 000 lux (~ 54 μmol m-2 s-1), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Quan sát, theo dõi, thu thập số liệu về
khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần), đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi ở 30 NSC Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2 4 2 6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp
Các phôi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm) được cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy trên, 30 g/L sucrose, nước dừa được khảo sát với các mức tỷ lệ (0%, 5%, 10%) Cấy 30 phôi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thu thập số liệu về số phôi hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi ở 21 NSC
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2 4 2 7 Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
Sử dụng các phôi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm), cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường MS hoặc ½MS (1/2 khoáng đa lượng) [105] không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, 20 g/L sucrose, cấy 30 phôi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần; quan sát, ghi nhận sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng thành ở 14 NSC Sau đó, cấy chuyển phôi sang môi trường đặc thích hợp (kế thừa kết quả thí nghiệm) để phôi phát triển thành cây con trong 60 ngày
2 4 3 Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp
Cắt tạo các LMTB dọc thân phôi/rễ, ngang phiến lá mầm (của phôi sơ cấp) mang phôi thứ cấp bằng dao lam, mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép của Bộ môn Thực vật - Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM [43] Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình
2 4 4 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định
Số phôi/cụm phôi Hệ số nhân phôi = = Tổng số phôi/số cụm phôi S phôi/c m phôiố ụ �ố �ℎô� �ấ�/�ụ�
Khối lượng tươi phôi thu nhận (g): Thu và cân sinh khối lượng phôi ở mỗi nghiệm thức sau 30 ngày nuôi
Hệ số nhân sinh khối phôi (lần) = � ℎ ố�ℎ ố� � � ượ �� �ượ�� �ℎô� ��ô� �ấ� (�) � ươ � �ℎ ô � ℎ ℎℎℎℎℎℎℎℎℎℎℎℎℎℎ �ℎ ậ � ( � )
2 5 Nội dung 3 Tạo rễ bất định
2 5 1 Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
2 5 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bấtđịnh trực tiếp từ mô lá định trực tiếp từ mô lá
Khảo sát tác động của riêng lẻ của auxin và môi trường khoáng lên sự cảm ứng tạo rễ bất định của mô lá, nhằm xác định loại và nồng độ auxin thích hợp, trên môi trường khoáng thích hợp
Sử dụng vật liệu là các mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm), cấy úp mặt trên lá tiếp xúc vào môi trường MS, ½MS, B5 và SH có bổ sung các chất ĐHST riêng lẻ NAA/IBA có cùng nồng độ (0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5) mg/L, 30 g/L sucrose, chiếu sáng 4 000 lux, 12 h chiếu sáng/ngày Cấy 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về các mức nồng độ của NAA/IBA và yếu tố về môi trường khoáng với 4 môi trường khác nhau (MS, ½MS, B5, SH) Theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) ở thời điểm 30 NSC
2 5 1 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
Nhằm khảo sát sự tác động của nồng độ đường đến sự phát sinh rễ từ các mẫu cấy mảnh lá, sử dụng môi trường khoáng với chất ĐHST (NAA/IBA) có nồng độ tạo rễ tích cực nhất (kế thừa từ thí nghiệm trên), có đường với các nồng độ khác nhau (20; 30; 40; 50 g/L) làm môi trường nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm) Mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy trên với 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố Theo dõi thí nghiệm, số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) được thu thập ở thời điểm 30 NSC
2 5 1 3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ môlá lá
Để khảo sát điều kiện chiếu sáng có tác động đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá, tiến hành cấy mẫu trên môi trường khoáng, có loại và nồng độ auxin thích hợp, nồng độ sucrose có tác động hiệu quả nhất đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên) Các đĩa mẫu cấy được đặt ở điều kiện chiếu sáng khác nhau 4 000 lux, 2 000 lux, tối hoàn toàn
Sử dụng vật liệu nuôi cấy là các mảnh lá I (10 x 10 mm) và mảnh lá II (3 x 10 mm) Với mảnh lá I cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; mảnh lá II cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu
nhiên, theo kiểu đơn yếu tố Quan sát, theo dõi thí nghiệm, ghi nhận số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu (tạo rễ), chiều dài rễ (mm) thu thập ở thời điểm 30 NSC
2 5 1 4 Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá
Cắt dọc các sơ khởi rễ 10 ngày tuổi, dài ~ 4 mm (hình thành trực tiếp ở mặt trên của mảnh lá nuôi cấy trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA) tạo LMTB bằng dao lam, vi phẫu được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [43] Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (độ phóng đại 20X) và chụp hình
2 5 2 Tạo rễ bất định từ chồi
2 5 2 1 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm
Khử trùng mẫu
Hình 2 3 Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi
A Nhánh cây (vạch ngang là vị trí cắt tạo các đốt thân; CL: cuống lá); B, C Các đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi (mũi tên chỉ vị trí chồi ở trạng thái ngủ) (thanh ngang 10 mm)
Sử dụng nhánh non (8 - 10 cm) cây NGBCC (Hình 2 3 A) Trước hết cắt bỏ lá, rửa nhánh dưới vòi nước chảy trong 10 phút, rửa tiếp bằng nước xà phòng Cắt nhánh thành các đoạn mang chồi ngủ - đốt nhánh (sau đây gọi là đốt thân) dài ~ 1,5 cm, không sử dụng chồi ngọn, tiếp theo khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, bằng nước Javel 30% (v/v) trong 30 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng Các đốt thân, sau khử trùng, cắt bỏ phần mô chết ở hai đầu (Hình 2 3 B, C) được dùng làm vật liệu nuôi cấy trong thí nghiệm tạo chồi
Tạo chồi từ đốt thân cây vườn ươm
Cấy các đốt thân sau khử trùng vào môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA và 2 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose [3] Ghi nhận sự tạo chồi ở 60 NSC
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi (cao ~ 1 cm) và cấy vào môi trường tạo rễ bất định ½MS có bổ sung 0,2 mg/L NAA [3], 20 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,8; IBA cũng được sử dụng
với nồng độ 0,2 mg/L Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố
2 5 2 2 Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro
Tạo chồi từ đốt thân cây in vitro
Cây in vitro ~ 5 tháng tuổi (có nguồn gốc từ phôi vô tính được nuôi trên môi trường ½MS không bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L sucrose) được cắt bỏ toàn bộ lá, sau đó cắt thân thành các đoạn dài ~ 8 mm mang chồi nách và cấy vào môi trường tạo chồi như trên Theo dõi sự tạo chồi ở 60 NSC
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi nách 60 ngày tuổi (cao 0,7 - 1 cm), cấy vào môi trường tạo rễ bất định như trường hợp trên Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC
2 5 2 3 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính
Sử dụng vật liệu cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính có chiều cao thân ~ 15 mm, cắt bỏ phần rễ trụ, giữ phần thân (trụ dưới lá mầm) và các lá phía trên, dùng như vật liệu tạo rễ bất định Mẫu được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA cùng nồng độ 0,1 mg/L, 20 g/L sucrose Cấy 2 chồi/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%); số rễ/mẫu; chiều dài rễ (mm) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ tại thời điểm 30 NSC
2 5 3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu Chiều dài rễ (mm) = = =
(Số mẫu tạo rễ/số mẫu cấy) x 100% Tổng số rễ/số mẫu tạo rễ
Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
Các chỉ tiêu của thí nghiệm tạo rễ từ chồi đốt thân cây in vitro được thu thập ở 60 NSC: Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (mm) = = =
(Số chồi tạo rễ/số chồi cấy) x 100% Số rễ hình thành/số chồi tạo rễ Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
2 6 Nội dung 4 Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng
2 6 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ
Sử dụng các rễ đơn (rễ sơ cấp, dài ~ 1 cm) tái sinh trực tiếp từ mảnh lá trên môi trường đặc ½MS có 3 mg/L NAA ở thời điểm 20 NSC làm vật liệu nuôi cấy
Cấy ~ 120 rễ đơn vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL (~ 0,5% - w/v) môi trường lỏng ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA với các nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 3 mg/L Sau 20 ngày nuôi cấy lấy ngẫu nhiên 30 rễ/lần, 3 lần đo đếm, thu thập số liệu về chiều dài rễ sơ cấp (mm), số rễ thứ cấp cấp 1, chiều dài rễ thứ cấp cấp 1 (mm), số rễ thứ cấp (sau đây gọi là rễ nhánh) cấp 2 hình thành và đặc điểm hình thái rễ
2 6 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Cấy khối lượng rễ 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường ½MS bổ sung NAA/IBA với nồng độ kế thừa kết quả thí nghiệm (2 6 1); sucrose với các nồng độ (20, 30 và 40 g/L) Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở thời điểm 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố nồng độ sucrose với ba mức nồng độ (20, 30, 40 g/L)
2 6 3 Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng sinh khối rễ, sử dụng khối lượng rễ 0,35 g; 0,70 g; 1,4 g; 2,1 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA có nồng độ kế thừa thí nghiệm (2 6 1), nồng độ sucrose được sử dụng từ thí nghiệm (2 6 2) Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố khối lượng rễ nuôi cấy với bốn mức nồng độ (0,35; 0,7; 1,4; 2,1%)
2 6 4 Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian
Cấy khối lượng rễ thích hợp nhất (từ kết quả của thí nghiệm 2 6 3) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường nuôi cấy giống với thí nghiệm (2 6 3) Sau thời gian nuôi cấy 28 ngày, tiến hành thay 70 mL môi trường nuôi cấy có thành phần giống môi trường ban đầu Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) ở 7, 14, 21, 28, 35, 42 và 49 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm
bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố thời gian với các mức thời gian (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 ngày)
2 6 5 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Chiều dài rễ sơ cấp (mm) Số rễ nhánh cấp 1
= =
Chiều dài các rễ/số rễ được đo
Số rễ hình thành từ rễ sơ cấp/số rễ sơ cấp Chiều dài rễ nhánh cấp 1 (mm) = Chiều dài của các rễ nhánh/số rễ nhánh