SH, 30 NSC
NAA BA Số phôi Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi (mg/L) (mg/L) thứ cấp
0 0,25 0,00e* Không có hiện tượng tạo phôi thứ cấp; phôi sơ cấp phát triển với hình thái rễ, thân và lá mầm rõ rệt 1 0,25 15,23d Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn, màu hơi xanh; cụm
phôi ít rễ
2 0,25 17,30c Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn/thon dài, màu hơi xanh; cụm phôi ít rễ
3 0,25 19,37a Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều rễ Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi cấy ban đầu
4 0,25 18,56b Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều rễ Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi cấy ban đầu và ở rễ
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD
Từ kết quả trên, 04 nghiệm thức NAA (1; 2; 3; 4 mg/L) được tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng vì ở nồng độ 5 mg/L NAA, phôi có lá mầm rất to, rễ rất to và rất dài có thể gây hạn chế quá trình nhân phôi Kết quả cho thấy số phôi thứ cấp phát sinh từ phôi sơ cấp đơn nuôi cấy trong môi trường có 1; 2; 3; 4 mg/L NAA lần lượt là 15,23; 17,30; 19,37; 18,56 (Bảng 3 9) và phôi thứ cấp hình thành ở phần thân phôi sơ cấp (Hình 3 21D,E,F,G) Ở phôi nuôi cấy trong môi trường không bổ sung NAA, không ghi nhận hiện tượng tạo phôi thứ cấp (Hình 3 21C) Tuy số phôi ở nghiệm thức 2 mg/L NAA không nhiều như ở 02 nghiệm thức 3 mg/L và 4 mg/L NAA nhưng phôi thứ cấp hình thành có dạng nốt tròn/thon dài với
số lượng khá nhiều, rễ phôi ngắn - tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu nhân phôi sau này
Như đã nêu trên, vai trò của auxin và cytokinin là rất quan trọng đối với sự hình thành/phát triển phôi nói chung và nói riêng đối với phôi nuôi lỏng [22][149] Môi trường lỏng MS có bổ sung 0,5 μM NAA và 5 μM BA tạo hiệu quả cao đối với sự hình thành phôi Narcissus từ nuôi cấy mô sẹo có KNSP có nguồn gốc mô bầu noãn [150] Tương tự, môi trường lỏng MM có 2 mg/L NAA kích thích sự tạo phôi từ mô sẹo có KNSP (từ nuôi cấy mảnh lá non) và môi trường có 2 mg/L BA tạo phôi Coffea arabica với lá mầm phát triển [151]
Hình 3 21 Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC
A Bình phôi đơn thu thập dùng thí nghiệm; B Cận cảnh phôi đơn dùng nuôi cấy; C
Cận cảnh phôi nuôi trong môi trường không bổ sung NAA (ĐC); D,E,F,G Phôi thứ cấp hình thành ở môi trường SH có 1, 2, 3, 4 mg/L NAA
3 2 2 2 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khốiphôi phôi
Sau 45 ngày nuôi cấy, kết quả thí nghiệm thu được ở (Bảng 3 10) cho thấy, KLP nuôi cấy là 0,3 g (0,5%) có hệ số nhân sinh khối có giá trị thấp nhất là 10,40 và KLTP thu nhận được là 3,12 g (Hình 3 22A); khi KLP nuôi cấy là 1,2 g (2%) thu được KLTP là 17,85 g có hệ số nhân sinh khối cao nhất 14,88 (Hình 3 22C); KLP thu nhận được
đạt giá trị cao nhất là 23,45 g nhưng hệ số nhân sinh khối chỉ đạt 13,03 ở trường hợp KLP nuôi cấy là 1,8 g (3%) (Hình 3 22D) Như vậy, khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến sinh khối phôi thu nhận được, do liên quan đến mật độ trong bình nuôi cấy
Trong nuôi cấy mô sinh phôi/phôi nói chung, mật độ mẫu cấy (khối lượng mẫu cấy - g hoặc số phôi)/đơn vị thể tích môi trường có vai trò quan trọng Khi mật độ nuôi cấy cao, làm hạn chế tiếp xúc của phôi cấy với chất dinh dưỡng và oxygen của môi trường nuôi cấy, gây ra sự cạnh tranh, do đó làm giảm sự hấp thu chất dinh dưỡng và oxygen, nên ảnh hưởng không tốt đến sinh trưởng của phôi [152] Vì vậy, xác định khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu rất quan trọng cho sự tăng trưởng sinh khối phôi Như vậy, trong thí nghiệm này, sử dụng khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu là 1,2 g (tương ứng 2% w/v) thì sự tăng trưởng sinh khối phôi NGBCC đáp ứng sinh trưởng tốt với hệ số nhân cao nhất
Bảng 3 10 Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC
KLP nuôi cấy (g) 0,30 (0,5%) 0,60 (1%) 1,20 (2%) 1,80 (3%) KLTP thu nhận (g) 3,12d* 6,75c 17,85b 23,45a Hệ số nhân sinh khối (lần) 10,40d 11,25c 14,88a 13,03b
Đặc điểm hình thái cụm phôi
Cụm phôi nhỏ, lá mầm to Cụm phôi to, lá mầm to Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD
Hình 3 22 Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 45 NSC
A,B,C,D Môi trường nuôi cấy SH có 2 mg/L NAA và 0,25 mg/L BA, với khối lượng phôi nuôi cấy 0,3 g; 0,6 g; 1,2 g; 1,8 g
Đã ghi nhận một số nghiên cứu về khối lượng mẫu cấy ban đầu ảnh hưởng đến hiệu quả của sự phát sinh phôi, như C Guillou và cộng sự (2018) nghiên cứu về phát sinh phôi của Theobroma cacao khi nuôi cấy trong bình tam giác đã sử dụng 1 – 2% (w/v) mô sinh phôi PEMs (pro-embryogenic masses) là phù hợp; ngược lại, 5% gây ức chế sinh trưởng [153] Tương tự, B B Misra và S Dey (2013), khi nuôi cấy mô sinh phôi Santalum album (trong bioreactor 1,5 – 7,5 L) với khối lượng cấy ban đầu là 1 – 2% là thích hợp nhất [154] Đối với nuôi cấy phôi chuối lá [plantain FHIA-21 AAAB)] trong bình tam giác, García-Águila và cộng sự (2016) kết luận khối lượng cấy ban đầu thích hợp là 2% (qua so sánh các khối lượng phôi nuôi cấy từ 0,7% đến 2,7%) [155]
Hình 3 23 Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60 NSC
A Cụm phôi dùng nuôi cấy; B,C Bình nuôi phôi ở 30 NSC, 60 NSC; D,E Phôi với các dạng phát triển và kích thước khác nhau; F Tập hợp phôi thu được ở 60 NSC; G, H Các dạng phôi điển hình (PC: phôi cầu, PTL: Phôi thủy lôi, PT: Phôi tim); I Các dạng phát triển phôi từ dạng cầu đến dạng trưởng thành; J Phôi trưởng thành sau cấy chuyển sang môi trường đặc Hình được chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 10X (I,J), 20X (G,H)
Trong quá trình nuôi lỏng lắc, nhận thấy có hiện tượng tạo phôi thứ cấp liên tục theo chu kỳ để tạo các phôi/cụm phôi mới - phù hợp với kết quả nghiên cứu của [156][157] về sự hình thành cụm phôi theo chu kỳ (cyclic manner) từ cực rễ của phôi
Piper nigrum và từ cực chồi của phôi Elaeis guineensis, theo thứ tự Theo dõi trong thời gian dài (đến 60 ngày) cho thấy, các phôi do tác động cơ học của quá trình lắc và do tương tác với nhau đã treo vào môi trường với nhiều hình dạng (dạng cầu, tim, thủy lôi, hai lá mầm) và kích cỡ khác nhau (nhỏ, to, trung bình) (qua quan sát đáy bình nuôi) (Hình 3 23D,E,F,G,H)
Qua sàng lọc, tập hợp các phôi có kích thước khác nhau được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 3 24) Sự hình thành phôi/cụm phôi với các kích cỡ và hình dạng khác nhau đã được ghi nhận trong quá trình tạo/nhân phôi trên môi trường đặc [158] và trong môi trường lỏng [22]
Hình 3 24 Sự đa dạng của kích thước phôi từ quá trình nuôi lỏng lắc trong môi trường SH
A Tập hợp các loại phôi có kích thước khác nhau; B,C,D Tập hợp các phôi có kích thước nhỏ, trung bình, to, theo thứ tự