Kết quả (Biểu đồ 3 1, Hình 3 54) cho thấy rễ nuôi trong môi trường NAA tăng sinh khối chậm ở giai đoạn 7 NSC (sinh khối đạt 2,62 g, hệ số nhân 1,87), tăng trưởng rất nhanh ở ba giai đoạn 21, 28 và 35 NSC, khối lượng tươi rễ đạt lần lượt 7,90 g; 13,92 g và 17,42 g; hệ số nhân tương ứng là 5,64; 9,94 và 12,44 Ở các thời điểm 42 và 49 NSC, rễ đạt giá trị khối lượng tối đa lần lượt là 18,26 g và 18,47 g, tuy nhiên khối lượng tươi rễ ở thời điểm 49 NSC khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê
so với khối lượng tươi rễ thu nhận ở 42 NSC (do đã ở thời kỳ ổn định); ngoài ra, nhận thấy ở giai đoạn 49 NSC, một số rễ có hiện tượng hóa nâu (Hình 3 55) có thể do hàm lượng dinh dưỡng môi trường đã giảm nhiều Tương tự, rễ nuôi trong môi trường IBA cũng có xu hướng tăng sinh khối rất nhanh ở 28 NSC và đạt mức tối đa ở 42 NSC (Hình 3 54G,H) (khối lượng tươi rễ lần lượt là 12,83 g và 16,91 g; hệ số nhân tương ứng là 9,16 và 12,08), đến giai đoạn 49 NSC nhận thấy khối lượng rễ tươi thu nhận được không có sự khác biệt về mặt thống kê so với thời điểm 42 NSC Rễ nuôi trong môi trường có NAA phát triển nhanh hơn về khối lượng ở từng thời điểm và từng nồng độ so với rễ trong môi trường có IBA (Hình 3 54G,H)
20 00 18 26a 18 47a 20 00 18 00 17 42b 16 91c 17 07bc 16 12d 16 00 13 92e 16 00 14 00 12 00 10 00 12 83f 9 94e 12 44b 11 50d 13 04a 12 08c 13 19a 12 00 12 19bc 8 00 7 90g 7 15h 9 16f 8 00 6 00 4 00 2 62k 2 00 1 87k 2 18l 5 13i 4 52j 3 66i 3 23j 5 64g 5 11h 4 00 1 56l 0 00 0 00 7 14 21 28 35 42 49
Thời gian (ngày) Khối lượng rễ thu nhận (NAA) Hệ số nhân sinh khối (NAA)
Khối lượng rễ thu nhận (IBA) Hệ số nhân sinh khối (IBA)
Biểu đồ 3 1 Diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian, 7 – 49 NSC Nhằm thu sinh khối ở mức tối ưu dùng cho các mục đích khác nhau, đối với bất kỳ hệ thống nuôi cấy (lỏng lắc, bioreactor) và vật liệu nuôi cấy nào (tế bào, phôi, rễ, ), khảo sát động học tăng trưởng theo thời gian của vật liệu nuôi cấy là yêu cầu quan trọng Trong điều kiện nuôi lỏng lắc, nhiều tài liệu cho thấy giai đoạn rễ đạt giá trị khối lượng tối đa ở một thời điểm nuôi cấy nhất định tùy thuộc vào loài thực vật, cụ thể Ahmad và cộng sự (2020) ghi nhận 3 pha tăng trưởng của rễ bao gồm pha mở đầu (7 – 9 ngày), pha tăng trưởng rất nhanh (12 - 27 ngày) và đạt mức ổn định từ 27
Kh ối lượ ng rễ thu nhậ n (g) Hệ số nhâ n sin h khố i (lầ n)
– 30 ngày qua nghiên cứu nuôi rễ bất định Stevia rebaudiana [204]; cũng qua nghiên cứu sự phát triển sinh khối theo thời gian (từ 7 – 49 ngày) của rễ bất định Prunella vulgaris, Fazal và cộng sự (2014) cho thấy khối lượng tươi rễ đạt mức cao nhất chỉ sau 21 ngày nuôi [196] Sinh khối rễ Psoralea corylifolia đạt mức tối đa sau 4 tuần nuôi cấy [198]; cần 5 tuần đối với rễ Panax notoginseng [44], Vernonia amygdalina
[185], 6 tuần đối với rễ chicory (Cichorium intybus) tuy nhiên, rễ Cichorium intybus
mất dần khả năng tạo rễ nhánh khi duy trì nuôi cấy dài hạn [184]
Hình 3 54 Tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian
A,B Sinh khối rễ trong môi trường có 2 mg/L NAA ở 14 NSC, 21 NSC; C,D Sinh khối rễ trong môi trường có 2 mg/L NAA ở 28 NSC, 35 NSC; E,F Sinh khối rễ trong môi trường có 2 mg/L NAA ở 42 NSC, 49 NSC; G,H Sinh khối rễ trong môi trường có 2 mg/L IBA ở 28 NSC, 42 NSC, theo thứ tự (thanh ngang 2 cm)
Nói chung, rễ NGBCC đã thể hiện các pha tăng trưởng trong nuôi cấy như pha mở đầu, tăng trưởng rất nhanh, pha ổn định và cần thời lượng 5 – 6 tuần để đạt mức khối lượng tươi rễ cao nhất (Biểu đồ 3 1) - phù hợp với nghiên cứu nuôi rễ của một số tác giả nêu trên Qua nuôi cấy dài hạn rễ NGBCC, không ghi nhận được trường hợp hóa thuỷ tinh thể dẫn đến mô ở trạng thái bị ‘trong’, có thể hoại tử sau đó – hiện tượng sinh lý thường gặp ở nuôi cấy mẫu ngập một phần/toàn phần (thường là chồi) trong môi trường lỏng [205]; cũng nhận thấy rễ không giảm khả năng phát sinh rễ thứ cấp, tạo tiền đề thuận lợi cho thử nghiệm nuôi nhân rễ ở quy mô lớn hơn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Trên cơ sở ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, lần đầu tiên trên đối tượng NGBCC, đã xác định được:
Sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mô lá hiệu quả nhất ở môi trường đặc SH có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% nước dừa; điều kiện chiếu sáng 4 000 lux Phát sinh phôi gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá ở môi trường đặc SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose
Môi trường nuôi cấy lỏng SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% nước dừa ở điều kiện chiếu sáng 4 000 lux là tối ưu cho sự phát sinh phôi thứ cấp, với khối lượng phôi nuôi cấy 2% và kích thước phôi nuôi cấy ~ 10 mm là hiệu quả nhất Phôi thứ cấp hình thành trong môi trường lỏng lắc hiệu quả hơn so với môi trường đặc
Sự tăng trưởng của cây con từ phôi vô tính hiệu quả nhất ở môi trường ½MS (20 g/L sucrose), cây con sinh trưởng bình thường ở điều kiện ex vitro
Rễ bất định phát sinh trực tiếp từ mô lá hiệu quả cao nhất trên môi trường đặc ½MS có bổ sung 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, điều kiện chiếu sáng 4 000 lux
Thu nhận sinh khối rễ bất định thông qua sự tạo rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc trong môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% đạt hiệu quả cao nhất
Rễ bất định phát sinh từ chồi đốt thân (cây vườn ươm/in vitro) nuôi cấy trên môi trường thích hợp ½MS có 0,2 mg/L NAA có 20 g/L sucrose Chồi có nguồn gốc phôi vô tính tạo rễ hiệu quả qua nuôi cấy trên môi trường đặc ½MS có 0,1 mg/L NAA (20 g/L sucrose)
Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính (ở các giai đoạn phát triển khác nhau) và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm kép đã được thực hiện có kết quả
Các kết quả nghiên cứu trên góp phần phát triển hướng nghiên cứu về cơ sở sinh lý của tính toàn thế của tế bào thực vật nói chung, ở đối tượng Schefflera octophylla nói riêng
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu nuôi nhân phôi vô tính, rễ bất định ở quy mô lớn bằng hệ thống bioreactor
Sử dụng sản phẩm sinh khối phôi vô tính (từ kết quả nhân phôi theo cơ chế tạo phôi thứ cấp), rễ bất định trong nghiên cứu nhân giống, thu nhận các hợp chất thứ cấp phục vụ lĩnh vực y dược/mỹ phẩm và trong một số nghiên cứu quan trọng khác như bảo quản nguồn gen, biến nạp gen,
DANH MỤC CÔNG TRÌNH
1 , Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Tạo phôi vô tính trực tiếp
từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour ) Harms, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, TP HCM, 2019, 405-410
2 , Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Tạo rễ bất định trực tiếp từ
mô lá cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour ) Harms nuôi cấy in vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2021, 19(3), 495-507
3 , Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Nhân rễ bất định cây Ngũ
gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour ) Harms bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2021, 6(3), 12-20
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 2 3 4 5 6 7
Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hương, Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss ) - Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển vọng ở Việt Nam, Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 5 về Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2013, 1152-1158
J Kitajima, M Shindo, Y Tanaka, Two new triterpenoid sulfates from the leaves of Schefflera octophylla, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 1990, 38(3), 714-716
Y L Li, D X Shi, M L Wang, Tissue culture and rapid propagation of Schefflera octophylla, Plant Physiology Communications, 2004, 40(2), 193 Y L Li, P P But, V E C Ooi, Antiviral activity and mode of action of caffeoylquinic acids from Schefflera heptaphylla (L ) Frodin, Antiviral Research, 2005, 68(1), 1-9
Y L Li, R W Jiang, L M S Ooi, P P H But , V E C Ooi, Antiviral triterpenoids from the medicinal plant Schefflera heptaphylla Phytother Research, 2007, 21(5), 466-470
Y L Li, C M Yeung, L C M Chiu, Y Z Cen, V E C Ooi, Chemical
composition and antiproliferative activity of essential oil from the leaves of a medicinal herb, Schefflera heptaphylla, Phytother Research, 2009, 23(1), 140- 142
Y F Chen, S H Tao, F L Zeng, L W Xie, Z B Shen, Antinociceptive and anti- inflammatory activities of Schefflera octophylla extracts, Journal Ethnopharmacology, 2015, 171, 42-50
8
9
X Liu, Y Niu, J Liu, R Xu, M Shi, W Kang, Efficient extraction of anti- inflammatory active ingredients from Schefflera octophylla leaves using ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction coupled with HPLC, Molecules, 2019a, 24(16), 2942
X Liu, J Dong, Q Liang, H M D Wang, X H Liu, Coagulant effects and mechanism of Schefflera heptaphylla (L ) Frodin, Molecules, 2019b, 24(24), 4547
10 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mẫn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Viện Dược liệu, 2006, 2, 411-414 11 Đặng Thị Thanh Tâm, Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Tam thất, Ngũ gia bì chân
chim và thử nghiệm quá trình sản xuất sinh khối bằng bioreactor, Báo cáo tổng hợp đề tài KC 04 TN10/11-15 thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước (KC 04/11-15), Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2012
12 W Gaoyin, W Xiaoli, W Xiao, L Xian, W Yi, Changes in biochemistry and histochemical characteristics during somatic embryogenesis in Ormosia henryi Prain, BioRxiv, 2020; https://doi org/10 1101/2020 09 21 307009
13 L Guan, Y Li, K Huang, Z M Cheng, Auxin regulalation and MdPIN expression during adventitious root initiation in apple cuttings, Hoticulture Reseach, 2020, 7: 143
14 S K Verma, A K Das, S Gantait, S Gurel, E Gurel, Influence of auxxin and its polar transport inhibitor on the development of somatic embryos in Digitalis trojana, 2018, 8 (2), 99
15 Y H Su, L P Tang, X Y Zhao, X S Zhang, Plant cell totipotency: Insights into cellular reprogramming, Plant Biology Journal of Integrative, 2021, 63, 228– 240
16 N Vidal, C Sanchez, Use of bioreactor systems in the propagation of forest trees, Engineering in Life Sciences, 2019, 19 (12), 896-915
17 B Qiang, J Miao, N Phillips, K Wei, Y Gao, Recent advances in the tissue culture of American ginseng (Panax quinquefolius), Chemistry and
Biodiversity, 2020, 17(10), e2000366
18 F Engelmann, In vitro conservation of tropical plant germplasm - a review, Euphytica, 1991, 57, 227-243
19 Y Guan, S G Li, X F Fan, Z H Su, Application of somatic embryogenesis in woody plants, Front Plant Science, 2016, 7, 938
20 V Pikulthong, T Teerakathiti, A Thamchaipenet, S Peyachoknagul,
L and Curcuma mangga Valeton & Zijp Agriculture and Natural Resources, 2016, 50, 276-285
21 F Afreen, S M A Zobayed, T Kozai, Photoautotrophic culture of Coffea
arabusta somatic embryos: Development of a bioreactor for large-scale plantlet conversion from cotyledonary embryos Annals of Botany, 2002, 90, 21-29 22 H Etienne, D Breton, J C Breitler, B Bertrand, E Déchamp, R Awada, P
Marraccini, S Léran, E Alpizar, C Campa, P Courte, F Georget, J P Ducos,
Coffee somatic embryogenesis: How did research, experience gained and innovations promote the commercial propagation of elite clones from the two cultivated species? Frontiers in Plant Science, 2018, 9, 01630
23 Nguyễn Trung Thành và Paek Kee Yoeup, Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax ginseng C A Meyer: Ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2008, 24, 318-323
24 Dương Tấn Nhựt, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền Tối ưu hóa quá trình nhân nhanh và tích lũy saponin của rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv ) trong các hệ thống nuôi cấy, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2015, 13(3), 853-864
25 Y Wang, S Jia, Z Wang, Y Chen, S Mo, N N Sze, Planning considerations of green corridors for the improvement of biodiversity resilience in suburban areas, Journal of Infrastructure Preservation and Resilience, 2021, 2:6 26 H G A Engler and K A E Prantl, Die Natürlichen Pflanzenfamilien, 1894,
3(8): 38, Angelmann Publisher
27 Tự điển Bách khoa Dược học, Nhà xuất bản Từ điển Bách khoa Hà Nội, 1999, 433-434
28 Trần Văn Sung, G Adam, A sulphated triterpenoid saponin from Schefflera octophylla Phytochemistry, 1991, 30 (8), 2717-2720
29 Trần Văn Sung, J Peter, Katalinic, G Adam, A bisdesmosidic triterpenoid saponin from Schefflera octophylla, Phytochemistry, 1991a, 30 (11), 3717- 3720
octophylla, Phytochemistry, 1991b, 30 (7), 2349-2356
31 Trần Văn Sung, C Lavaud, A Porzel, W Steglich, G Adam, Triterpenoids and their glycosides from the bark of Schefflera octophylla, Phytochemistry, 1992, 31(1), 227-231
32 C Wu, Y H Duan, M M Li, W Tang, X Wu, G C Wang, Triterpenoid
saponins from the stem barks of Schefflera heptaphylla, Planta Medica, 2013, 79(14), 1348-1355
33 C Wu, Y H Duan, W Tang, M M Li, X Wu, G C Wang, W C Ye, G X Zhou, New ursane-type triterpenoid saponins from the stem bark of Schefflera
heptaphylla, Fitoterapia, 2014, 92, 127-132
34 S Arya, I D Arya, T Eriksson, Rapid multiplication of adventitious somatic embryos of Panax ginseng, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1993, 34, 157- 162
35 Y E Choi, J H Jeong, C K Shin, Hormone-independent embryogenic callus production from ginseng cotyledons using high concentrations of NH4NO3 and progress towards bioreactor production Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2003, 72(3), 229-235
36 S Zhou and D C Brown , High efficiency plant production of North American ginseng via somatic embryogenesis from cotyledon explants, Plant Cell Reports,
2006, 25(3), 166-173
37 Y L Kim, K Kim, O R Lee, D C Yang, High frequency of plant regeneration through cyclic secondary somatic embryogenesis in Panax ginseng Journal Ginseng Research, 2012, 36(4), 442-448
38 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn
Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt, Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống lá và thân rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv ), Tạp chí Sinh học, 2014, 36(1), 277-282
39 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Vũ Thị Thủy, Nguyễn Hồng Hoàng, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt, Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trìmh phát sinh hình thái của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv ) in vitro, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2015, 13(4), 657-664
40 Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Đức Trí, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ,
Nghiên cứu tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv ) trong môi trường lỏng, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2014, 12(7), 1085-1095
41 J Y Zhang, H J Sun, I J Song, T W Bae, H G Kang, S M Ko, Y I Kwon, I W Kim, J Lee, S Y Park, P O Lim, Y H Kim, H Y Lee, Plant regeneration of Korean wild ginseng (Panax ginseng Meyer) mutant lines induced by γ- irradiation (60Co) of adventitious roots Journal Ginseng Research 2014, 38(3), 220-225
42 Đỗ Mạ nh Cường, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Đắ c Khả i, Vũ Qu ốc Lu ận,Vũ Th ị Hiền, Trương Thị Bích Phượng, D ương T ấ n Nhựt, Increasing the somatic embryogenesis frequency of Panax vietnamensis Ha et Grushv by disinfection of leaf explant using nano silver and the addition of nano silver in culture medium, Vietnam Journal of Biotechnology, 2020, 18, 517-527
43 Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng, Trương Thị Đẹp, Biến đổi hình thái trong phát sinh phôi soma thông qua nuôi cấy mô sẹo Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H T Tsai et K M Feng), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2018, 16(2),