Cắt dọc các sơ khởi rễ 10 ngày tuổi, dài ~ 4 mm (hình thành trực tiếp ở mặt trên của mảnh lá nuôi cấy trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA) tạo LMTB bằng dao lam, vi phẫu được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [43] Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (độ phóng đại 20X) và chụp hình
2 5 2 Tạo rễ bất định từ chồi
2 5 2 1 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm
Khử trùng mẫu
Hình 2 3 Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi
A Nhánh cây (vạch ngang là vị trí cắt tạo các đốt thân; CL: cuống lá); B, C Các đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi (mũi tên chỉ vị trí chồi ở trạng thái ngủ) (thanh ngang 10 mm)
Sử dụng nhánh non (8 - 10 cm) cây NGBCC (Hình 2 3 A) Trước hết cắt bỏ lá, rửa nhánh dưới vòi nước chảy trong 10 phút, rửa tiếp bằng nước xà phòng Cắt nhánh thành các đoạn mang chồi ngủ - đốt nhánh (sau đây gọi là đốt thân) dài ~ 1,5 cm, không sử dụng chồi ngọn, tiếp theo khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, bằng nước Javel 30% (v/v) trong 30 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng Các đốt thân, sau khử trùng, cắt bỏ phần mô chết ở hai đầu (Hình 2 3 B, C) được dùng làm vật liệu nuôi cấy trong thí nghiệm tạo chồi
Tạo chồi từ đốt thân cây vườn ươm
Cấy các đốt thân sau khử trùng vào môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA và 2 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose [3] Ghi nhận sự tạo chồi ở 60 NSC
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi (cao ~ 1 cm) và cấy vào môi trường tạo rễ bất định ½MS có bổ sung 0,2 mg/L NAA [3], 20 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,8; IBA cũng được sử dụng
với nồng độ 0,2 mg/L Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố
2 5 2 2 Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro
Tạo chồi từ đốt thân cây in vitro
Cây in vitro ~ 5 tháng tuổi (có nguồn gốc từ phôi vô tính được nuôi trên môi trường ½MS không bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L sucrose) được cắt bỏ toàn bộ lá, sau đó cắt thân thành các đoạn dài ~ 8 mm mang chồi nách và cấy vào môi trường tạo chồi như trên Theo dõi sự tạo chồi ở 60 NSC
Tạo rễ bất định từ chồi
Tách các chồi nách 60 ngày tuổi (cao 0,7 - 1 cm), cấy vào môi trường tạo rễ bất định như trường hợp trên Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC
2 5 2 3 Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính
Sử dụng vật liệu cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính có chiều cao thân ~ 15 mm, cắt bỏ phần rễ trụ, giữ phần thân (trụ dưới lá mầm) và các lá phía trên, dùng như vật liệu tạo rễ bất định Mẫu được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA cùng nồng độ 0,1 mg/L, 20 g/L sucrose Cấy 2 chồi/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%); số rễ/mẫu; chiều dài rễ (mm) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ tại thời điểm 30 NSC
2 5 3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu Chiều dài rễ (mm) = = =
(Số mẫu tạo rễ/số mẫu cấy) x 100% Tổng số rễ/số mẫu tạo rễ
Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
Các chỉ tiêu của thí nghiệm tạo rễ từ chồi đốt thân cây in vitro được thu thập ở 60 NSC: Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ/chồi Chiều dài rễ (mm) = = =
(Số chồi tạo rễ/số chồi cấy) x 100% Số rễ hình thành/số chồi tạo rễ Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo
2 6 Nội dung 4 Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng
2 6 1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ
Sử dụng các rễ đơn (rễ sơ cấp, dài ~ 1 cm) tái sinh trực tiếp từ mảnh lá trên môi trường đặc ½MS có 3 mg/L NAA ở thời điểm 20 NSC làm vật liệu nuôi cấy
Cấy ~ 120 rễ đơn vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL (~ 0,5% - w/v) môi trường lỏng ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA với các nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 3 mg/L Sau 20 ngày nuôi cấy lấy ngẫu nhiên 30 rễ/lần, 3 lần đo đếm, thu thập số liệu về chiều dài rễ sơ cấp (mm), số rễ thứ cấp cấp 1, chiều dài rễ thứ cấp cấp 1 (mm), số rễ thứ cấp (sau đây gọi là rễ nhánh) cấp 2 hình thành và đặc điểm hình thái rễ
2 6 2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Cấy khối lượng rễ 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường ½MS bổ sung NAA/IBA với nồng độ kế thừa kết quả thí nghiệm (2 6 1); sucrose với các nồng độ (20, 30 và 40 g/L) Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở thời điểm 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố nồng độ sucrose với ba mức nồng độ (20, 30, 40 g/L)
2 6 3 Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng sinh khối rễ, sử dụng khối lượng rễ 0,35 g; 0,70 g; 1,4 g; 2,1 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA có nồng độ kế thừa thí nghiệm (2 6 1), nồng độ sucrose được sử dụng từ thí nghiệm (2 6 2) Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố khối lượng rễ nuôi cấy với bốn mức nồng độ (0,35; 0,7; 1,4; 2,1%)
2 6 4 Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian
Cấy khối lượng rễ thích hợp nhất (từ kết quả của thí nghiệm 2 6 3) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường nuôi cấy giống với thí nghiệm (2 6 3) Sau thời gian nuôi cấy 28 ngày, tiến hành thay 70 mL môi trường nuôi cấy có thành phần giống môi trường ban đầu Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) ở 7, 14, 21, 28, 35, 42 và 49 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Thí nghiệm
bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố thời gian với các mức thời gian (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 ngày)
2 6 5 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Chiều dài rễ sơ cấp (mm) Số rễ nhánh cấp 1
= =
Chiều dài các rễ/số rễ được đo
Số rễ hình thành từ rễ sơ cấp/số rễ sơ cấp Chiều dài rễ nhánh cấp 1 (mm) = Chiều dài của các rễ nhánh/số rễ nhánh Số rễ nhánh cấp 2 = � ổ �� � ố � ễ �ℎ� á �ℎố � ℎễ �ℎá�ℎ �ấ� 1 ì �ℎ �ℎ à �ℎ � �ừ ễ � ấ � 1 Khối lượng tươi rễ (g): khối lượng rễ tươi thu nhận được 30 NSC
Hệ số nhân (lần) = �ℎố� �ượ�� ��ℎ ố � � ượ �� � ễễ ��ô� �ấ� (�) ℎℎ �ℎ ậ � ( � )
27 Điều kiện nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng 25 - 28oC, độ ẩm trung bình 50 – 60%, các thí nghiệm đều được đặt ở ngoài sáng để dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, chiếu sáng 12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4 000 lux (trừ thí nghiệm tạo phôi trực tiếp ở điều kiện tối đặt trong điều kiện tối hoàn toàn; thí nghiệm ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến tăng trưởng sinh khối phôi; thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định ở điều kiện sáng 2 000 lux, ở điều kiện tối mẫu đặt ở điều kiện tối hoàn toàn) Sử dụng môi trường đặc (agar 10 g/L, pH 5,8; hấp khử trùng ở 1 atm/121oC trong 20 phút); thí nghiệm trong môi trường lỏng lắc với tốc độ lắc 80 vòng/phút
2 8 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Các kết quả trung bình của 3 lần lặp lại được xử lý và phân tích bằng ANOVA một yếu tố, kiểm tra mức độ khác biệt giữa các nghiệm thức bằng LSD hoặc Duncan Các thí nghiệm 2 yếu tố được xử lý theo phân tích phương sai đa biến một chiều (One- way MANOVA) của phép thử Duncan với p ≤ 0,05 bằng phần mềm SPSS 25 0 (Số liệu tỷ lệ % biến động từ 0 – 100% chuyển đổi sang arcsin √� khi xử lý thống kê, hoặc từ 70 – 100% được chuyển đổi sang (x + 0,5)1/2
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3 1 Tạo phôi vô tính
Trong nghiên cứu này, phôi vô tính hình thành trực tiếp được định nghĩa là phôi tái sinh ngay ở lần nuôi cấy đầu tiên, khác với phôi tái sinh gián tiếp qua hai giai đoạn nuôi cấy là giai đoạn tạo mô sẹo và phát sinh phôi từ mô sẹo [108][109]
3 1 1 Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
3 1 1 1 Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôivô tính trực tiếp từ mô lá vô tính trực tiếp từ mô lá
Hình 3 1 Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô lá
A,B Phôi cầu đơn, cụm phôi cầu; C Phôi dạng tim (1) và dạng cầu (2); D Phôi dạng thủy lôi; E,F,G,H Phôi có lá mầm và rễ mầm phát triển; I Cây con hoàn chỉnh lá mầm, lá thật (đơn, kép), rễ cọc điển hình Mũi tên chỉ lá mầm (trắng), rễ mầm (đen) Thanh ngang 2 mm
Sau 5 tuần nuôi cấy, phôi vô tính xuất hiện ở nhiều nghiệm thức, ở môi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA phôi xuất hiện sớm và nhiều nhất, môi trường ½MS phôi phát sinh chậm, ít hơn Sự phân hóa cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC bắt đầu từ dạng phôi cầu, xuất hiện khoảng 32 – 35 NSC, có màu vàng nhạt (Hình 3 1A), giai đoạn phôi hình tim có màu xanh, xuất hiện sau đó khoảng 10 ngày, đây là dấu hiệu tiền hai lá mầm, dạng đặc trưng của sự hình thành phôi ở cây hai lá mầm (Hình 3 1C) Dạng phôi thủy lôi (Hình 3 1D) phát triển tiếp đến giai đoạn có hai lá mầm khoảng 15 – 20 ngày tiếp theo (Hình 3 1E,F,G,H) Phôi phát sinh trực
tiếp từ mảnh lá NGBCC đã trải qua tuần tự 04 dạng phát triển của phôi
Quan sát sự phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC nhận thấy, các hình dạng khác nhau và các giai đoạn phát triển của phôi cùng xuất hiện trên cùng mẫu cấy (Hình 3 1C1,C2), điều đó chứng tỏ quá trình phát sinh phôi không đồng bộ và các tế bào khi đủ điều kiện sẽ phát sinh phôi
Sau 60 ngày nuôi cấy, ở môi trường không bổ sung NAA/IBA, các mẫu cấy đều không phát sinh hình thái, không xuất hiện phôi, mẫu cấy hóa nâu và chết sau đó, điều đó chứng tỏ lượng chất ĐHST nội sinh ít không đủ cảm ứng phát sinh phôi Tất cả các mẫu cấy trên môi trường ½MS, MS, B5, SH có bổ sung IBA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L), đều không ghi nhận được cấu trúc phôi xuất hiện trong suốt 60 ngày nuôi cấy (không trình bày số liệu) Ngược lại, các nghiệm thức bổ sung NAA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L) vào môi trường nuôi cấy đều có cảm ứng tạo phôi vô tính theo hướng tích cực (Hình 3 2) Điều đó chứng tỏ, sự cảm ứng tạo phôi của mảnh lá NGBCC đối với mỗi loại auxin trong môi trường nuôi cấy là khác nhau và cần có loại auxin ngoại sinh thích hợp là NAA, còn IBA hoàn toàn không thích hợp cho sự cảm ứng tạo phôi
Kết quả (Bảng 3 1) cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu tăng khi tăng nồng độ NAA (1 – 5 mg/L) trong môi trường nuôi cấy, khi tăng nồng độ 6 mg/L NAA thì tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm Khi xét các mức nồng độ NAA và các loại môi trường khoáng, nhận thấy môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L NAA có tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) và số phôi/mẫu thấp nhất (24,44% và 6,18 phôi/mẫu) Các chỉ tiêu này đạt giá trị cao nhất khi môi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA với tỷ lệ mẫu tạo phôi 88,89% và 19,95 phôi/mẫu (Hình 3 2L) Kết quả này có ý nghĩa khác biệt về thống kê so với tất cả các nghiệm thức còn lại Điều đó chứng tỏ, tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) và số phôi/mẫu chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ của loại auxin thích hợp (NAA) và loại môi trường khoáng phù hợp Như vậy, nồng độ 5 mg/L NAA là tối ưu để kích thích tạo phôi đạt hiệu quả cao nhất từ mảnh lá NGBCC, trong môi trường nuôi cấy có hàm lượng và thành phần khoáng thích hợp là SH
Sự cảm ứng phát sinh phôi từ mô lá NGBCC chỉ ở những nghiệm thức có bổ sung NAA, số phôi phát sinh ít hoặc nhiều tùy thuộc nồng độ NAA sử dụng, điều này cho thấy vai trò của auxin ngoại sinh là mang tính quyết định Qua vết thương của mẫu cấy làm tăng sự hấp thụ auxin ngoại sinh, sự hiện diện của auxin ngoại sinh (NAA) trong tế bào làm tăng IAA nội sinh thông qua quá trình tổng hợp IAA nội
sinh, sự gia tăng của IAA nội sinh không thể thiếu để thay đổi chương trình di truyền dẫn đến phát sinh phôi, sự cân bằng nội môi của các auxin rất quan trọng cho cảm ứng tạo phôi [90] Sự khác nhau về loại và nồng độ auxin ngoại sinh áp dụng trong mối tương tác với sinh tổng hợp auxin nội sinh có vai trò quan trọng trong phát sinh phôi vô tính [88][89] Vai trò của auxin ngoại sinh và sự vận chuyển phân cực của auxin, đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh phôi vô tính, điều này được Verma và cộng sự (2018) chứng minh trong nghiên cứu tác động của auxin ngoại sinh đến phát sinh phôi vô tính trực tiếp của Digitalis trojana [14]
Như vậy, auxin trong đó có NAA là yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh phôi, có vai trò quan trọng kênh thông tin tế bào - làm tế bào biến đổi đến trạng thái cuối cùng đã được chương trình hóa là phát sinh phôi vô tính [65] Tuy nhiên khả năng đáp ứng tạo phôi của mô thực vật khác nhau đối với các loại auxin trong môi trường là khác nhau [70]
Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy
in vitro, chứa thành phần và hàm lượng các chất khoáng cần thiết cho sự phát sinh phôi Trong thí nghiệm này, sử dụng các môi trường khoáng thường sử dụng trong nghiên cứu phát sinh phôi vô tính ở họ Ngũ gia bì là MS, B5, SH [72][71][38] và ½MS Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy, phôi phát sinh cao nhất ở môi trường SH và thấp nhất ở môi trường ½MS, điều đó chứng tỏ thành phần và hàm lượng chất khoáng có tác động đến sự phát sinh phôi và môi trường khoáng SH thích hợp nhất cho cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá NGBCC
Như vậy, hiệu quả phát sinh phôi chịu ảnh hưởng bởi loại, nồng độ auxin thích hợp, hàm lượng và thành phần khoáng của môi trường nuôi cấy, trong đó auxin có vai trò quyết định Trong nghiên cứu này, tỷ lệ % mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu nhiều nhất ở môi trường nuôi cấy SH có 5 mg/L NAA Đây là nghiên cứu đầu tiên thực hiện thành công tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC
Thí nghiệm này, 2,4-D cũng đã được bố trí thực hiện trên NGBCC nhưng với kết quả âm tính trong tạo phôi, chỉ ghi nhận được hiện tượng hình thành mô sẹo
Theo một số tác giả, kiểu gen thực vật [109], loại môi trường khoáng cơ bản [110], một số thành phần khoáng đơn lẻ [111], công thức môi trường nuôi cấy bao gồm chất ĐHST, [112][70] có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành phôi vô tính trực tiếp/gián tiếp
Bảng 3 1 Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC NAA (mg/L) 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 Môi trường khoáng ½MS ½MS ½MS ½MS ½MS ½MS ½MS MS MS MS MS MS MS MS B5 B5 B5 B5 B5 B5 B5 SH SH SH SH SH SH SH Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) 0 00q* 24,44p 33,33o 42,22n 52,22l 56,67k 46,67m 0 00q 57,78k 61,11j 66,67gh 75,56c 78,89b 68,89f 0 00q