5. Tính mới của đề tài
3.1.1.5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính
Trong quá trình nuôi cấy tái sinh, trước và sau giai đoạn trưởng thành hầu hết các phôi tiếp tục sinh trưởng dẫn đến phát triển thân, lá mầm, rễ mầm, chồi/lá bình thường (Hình 3.7A). Ngược lại, bên cạnh dạng phôi vô tính hình thái tiêu biểu cũng đã ghi nhận được trường hợp phôi tái sinh (với số lượng không đáng kể) có hình dạng bất thường như phôi dính nhau ở phần lá mầm/thân, không có rễ mầm, chồi không phát triển (Hình 3.7B,C).
Hình 3.7. Phôi bình thường và một số dạng bất thường của phôi vô tính
A. Hình thái phôi bình thường; B. Hình thái phôi có lá mầm dị dạng, rễ mầm phát triển bình thường; C. Các phôi dính nhau với lá mầm dị dạng, có chung phần thân và không có rễ mầm. Thanh ngang 5 mm.
Sự phân chia tế bào ở vùng mô phân sinh xảy ra trước khi có sự biệt hóa của cực chồi và lá mầm, nếu sự phân bào vẫn tiếp tục sau khi hình thành sơ khởi lá mầm,
dẫn đến hình thành phôi bất thường có hai hay nhiều phôi dính lại với nhau (Hình 3.7C). Miekle và cộng sự, (1995) cho rằng, các lá mầm hợp nhất như vậy cũng là đặc điểm của phôi soma dạng sừng thường được phục hồi từ nuôi cấy tế bào, có thể là auxin ngoại sinh hiện diện trong môi trường có thể đủ làm nhiễu loạn sự vận chuyển bình thường của auxin trong phôi ở giai đoạn hình cầu, làm cho sự phát triển lá mầm bình thường bị ngăn cản [108].
Phôi phát triển với 2 lá thật nhỏ ban đầu (Hình 3.8A) được nuôi cấy trên môi trường MS và ½MS [54] không bổ sung chất ĐHST để so sánh khả năng tạo cây hoàn chỉnh. Kết quả cho thấy, cây con ở hai môi trường này phát triển khá khác biệt ở 90 NSC. Chiều cao cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ trung bình của cây ở môi trường ½MS, MS lần lượt là 2,63 cm; 5,2; 7,3; 9,6 cm; là 2,58 cm; 4,9; 6,5 và 6,9 cm, theo thứ tự (không trình bày bảng số liệu). Như vậy, môi trường ½MS là thích hợp cho việc tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính (Hình 3.8C). Điểm đặc biệt là các lá thật hình thành ban đầu ở cây con đều là các lá đơn, sau đó mới tạo các lá kép có thùy (lá đơn) đặc trưng (Hình 3.8B,C).
Hình 3.8. Tạo cây con từ phôi vô tính trên môi trường MS, ½MS không có chất ĐHST.
A. Vật liệu phôi dùng thí nghiệm tạo cây con; B,C. Cây con từ phôi nuôi cấy trên môi trường MS, ½MS.
Điểm đặc biệt ở NGBCC là phôi có thể tạo chồi khá thuận lợi trên môi trường không bổ sung chất ĐHST; theo chúng tôi, có thể do phôi không ở trạng thái ngủ/hưu miên (dormancy) như ở một số trường hợp khác như phôi các dòng Panax ginseng
đột biến [41] và dòng lai khác loài giữa Panax ginseng và Panax quinquefolius [118] - đều cần được nuôi cấy trên môi trường có GA3 (5 mg/L); và cũng cần được nuôi trên môi trường có bổ sung BA (1 mg/L), NAA (0,2 mg/L) đối với Coriandrum sativum [119]. Qua thử nghiệm nuôi cấy ban đầu 200 phôi, ghi nhận được số phôi tạo chồi (sau ~ 3 tháng nuôi) là 196 (tỷ lệ 98%). Theo Sliwinska và cộng sự (2008), môi
trường ½MS không bổ sung chất ĐHST là thích hợp cho sự tạo cây từ phôi chỉ trong một lần nuôi cấy đối với Đinh lăng Polyscias filicifolia [54].
3.1.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
Hình 3.9. Trồng cây từ phôi vô tính ra chậu đất ở vườn ươm
A. Bình cây chuẩn bị đưa ra trồng ở vườn ươm, ở 90 NSC; B,C. Cây từ phôi ở chậu đất vườn ươm sau 3 - 6 tháng trồng. D. Cây sau 12 tháng trồng.
Các cây con (nuôi trong bình tam giác chứa môi trường ½MS) (Hình 3.9A) được đem trồng ra chậu chậu đất, kết quả cho thấy các lá mầm dần thoái hóa, cây có tỷ lệ sống rất cao (≥ 95%) tính đến thời điểm 3 tuần sau trồng và cây có sinh trưởng/kiểu hình bình thường trong điều kiện vườn ươm; số lá chét ban đầu thường thấp hơn so với cây mẹ, tăng dần ở thời gian sau đó (Hình 3.9B,C).