5. Tính mới của đề tài
3.1. Tạo phôi vô tính
2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá trực tiếp từ mô lá
Để khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của loại auxin với nồng độ thích hợp và môi trường khoáng đến sự phát sinh phôi trực tiếp từ mảnh lá, tiến hành bố trí thí nghiệm theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST với các mức nồng độ khác nhau; yếu tố về môi trường khoáng với 4 loại môi trường.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Môi trường nuôi cấy là ½MS, MS [105], B5 [106]vàSH [107] bổ sung loại auxin riêng lẻ (NAA hoặc IBA) ở các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 mg/L), có chứa 30 g/L đường (sucrose). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, tiến hành cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu tạo phôi tại thời điểm 60 NSC.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
Cắt dọc phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) thành lát mỏng bằng dao lam, ngâm vi phẫu vào nước javel đến khi mẫu trắng (loại bỏ nội chất tế bào), rửa sạch mẫu bằng nước cất. Sau đó, ngâm vi phẫu trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút (loại bỏ javel trước khi nhuộm). Thực hiện nhuộm kép vi phẫu bằng thuốc nhuộm son phèn - lục iod trong 15 phút, rửa sạch mẫu [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Chỉ tiêu theo dõi: Các dạng hình thái của phôi vô tính (dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, phôi dạng hai lá mầm)
2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
Nhằm xác định nồng độ BA tối ưu kết hợp với loại auxin có nồng độ thích hợp đến cảm ứng tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm
Môi trường nuôi cấy là môi trường khoáng có loại auxin với các nồng độ có tác động tích cực đến sự hình thành phôi (kế thừa kết quả từ thí nghiệm 2.3.1.1) và có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,25; 0,5; 1mg/L), 30 g/Lsucrose. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về nồng độ của loại auxin với các mức nồng
BA (có 4 mức nồng độ). Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.
2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá trực tiếp từ mô lá
Khảo sát nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng thích hợp đến cảm ứng tạo phôi. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường khoáng có nồng độ của loại auxin (NAA/IBA); nồng độ BA (kế thừa kết quảtừhai thí nghiệm trên) có bổ sung sucrose với các nồng độ khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L) và nuôi mẫu ở điều kiện chiếu sáng/tối. Ở điều kiện chiếu sáng, mẫu đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, chiếu sáng 12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4.000 lux; ở điều kiện tối mẫu đặt trong điều kiện tối hoàn toàn.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố sucrose với 4 mức nồng độ khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L), yếu tố điều kiện chiếu sáng với 2 mức sáng (4.000 lux)/tối. Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.
2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá
Các điều kiện tối ưu của thí nghiệm 2.3.1.3 được áp dụng làm môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa với các tỷ lệ khác nhau 0, 5, 10, 15, 20% (v/v); để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận tại thời điểm 60 NSC gồm tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố.
2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính
Nhằm xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo cây con in vitro hoàn chỉnh, từ đó tạo cây con có thân, bộ lá, rễ tốt phục vụ việc trồng cây ra chậu đất.
Vật liệu nuôi cấy là các cây con có thân cao ~ 1 cm, đã có lá thật 3 – 4 mm (nguồn gốc từ phôi vô tính).
Tách các cây con, nuôi cấy trên các đĩa petri có chứa 30 mL môi trường nuôi cấy là MS hoặc ½MS, có chứa 20 g/L sucrose, không bổ sung chất ĐHST. Cấy 5 cây con/đĩa với 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát hình thái cơ bản,
thu thập số liệu về các chỉ tiêu theo dõi sau cấy 90 ngày. Tại thời điểm 90 NSC tiến hành đo đếm các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá/cây, số rễ/cây; chiều dài rễ (mm): được xác định từ gốc rễ đến chóp rễ; quan sát hình thái cơ bản.
Sử dụng môi trường tốt nhất của thí nghiệm làm môi trường nuôi cấy tạo nguồn cây con in vitro khỏe mạnh. Sử dụng các cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính như trên cấy vào bình tam giác chứa 50 mL môi trường nuôi cấy, cấy 3 cây/bình, 10 bình/lần lặp lại, lặp lại 3 lần. Sau 3 tháng thu các cây con để trồng ra chậu đất ở vườn ươm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
Các cây con 3 tháng tuổi được nuôi cấy trong bình tam giác (từ kết quả thí nghiệm trên), lấy ra khỏi bình tam giác, rửa sạch agar, bảo quản và đảm bảo độ ẩm tránh mất nước cho cây, sau đó được trồng ra chậu (có Ø ~ 20 cm) chứa đất sạch thương hiệu Tribat (Cty TNHH Công nghệ sinh học Sài Gòn Xanh, TP. HCM). Các chậu cây được đặt trong vườn ươm, trồng 1 cây con/chậu, 10 chậu/lần lặp lại, 3 lần lặp lại, ghi nhận tỷ lệ sống (%) và hình thái cơ bản của cây con ở thời điểm 3 tuần sau trồng.
Tỷ lệ sống (%) = (Số cây sống/số cây trồng) x 100%
Trồng cây ở vườn ươm với điều kiện che sáng ~ 50% bằng lưới đen (cường độ sáng ~ 8.000 lux), tưới phun 2 ngày/lần, nhiệt độ 30 - 32oC, độ ẩm 60 - 70%. Theo dõi, ghi nhận, đánh giá cảm quan hình thái cây đến giai đoạn 3 - 12 tháng sau trồng.
2.3.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá
2.3.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)
Tạo mô sẹo
Vật liệu nuôi cấy: các mảnh lá có kích thước 10 x 10 mm
Mẫu được cấy vào môi trường tạo mô sẹo SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ (0; 1; 2; 3 mg/L), 30 g/L sucrose. Sau cấy 40 ngày, cấy chuyền các mẫu và nuôi tiếp trong 20 ngày nhằm để mô sẹo hình thành trên toàn bộ bề mặt mảnh lá. Thí nghiệm được thực hiện trên các đĩa petri, cấy 5 mảnh lá/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại. Quan sát, theo dõi sự hình thành mô sẹo ở 20, 40, 60 NSC.
Cắt các mảnh lá mang mô sẹo (sau đây gọi tắt là mảnh mô sẹo) ở 60 NSC nói trên thành các mảnh có kích thước (~ 10 x 10 mm/~ 1 cm2), nuôi cấy tiếp trong thời
gian 30 ngày để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi (KNSP). Tiến hành cấy 5 mảnh mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu ở thời điểm 30 NSC: tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo có KNSP (%), số cụm mô sẹo có KNSP/mẫu mô sẹo.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Xác định mô sẹo có KNSP dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, cấu trúc, mô sẹo có KNSP: có dạng cứng, trắng hơi vàng, vàng, cấu trúc chắc, dạng cụm hoặc hạt, phát triển chậm. Mô sẹo không có KNSP có cấu trúc xốp, phát triển nhanh, màu trắng hoặc xám, mềm.
Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường đặc
Vật liệu nuôi cấy: các cụm mô sẹo có KNSP
Các cụm mô sẹo có KNSP thu từ thí nghiệm trên được cắt thành các cụm nhỏ có kích thước ~ 5 mm, cấy vào môi trường tạo phôi là môi trường nuôi cấy có bổ sung loại auxin và nồng độ thích hợp của BA (kế thừa kết quả thí nghiệm tạo phôi trực tiếp). Loại auxin này được bố trí với các nồng độ 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; có 30 g/L sucrose.
Tiến hành cấy 5 cụm mô sẹo có KNSP/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố . Theo dõi, ghi nhận số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu theo dõi: số cụm mô sẹo có KNSP tạo phôi, số phôi/cụm mô sẹo có KNSP, đặc điểm hình thái phôi.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi trường đặc
Sử dụng dao lam cắt ngang phôi tái sinh từ cụm mô sẹo có KNSP nuôi trên môi trường đặc để tạo các lát mỏng tế bào, tiếp theo các mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm màu kép như trên [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường lỏng
Thí nghiệm được tiến hành với nguồn vật liệu là các cụm mô sẹo có KNSP có đường kính khoảng 5 mm, cấy 30 cụm mô sẹo có KNSP vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường kế thừa từ kết quả thí nghiệm trên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành phôi ở 10, 14, 30 NSC.
Quan sát, ghi nhận hình thái cụm tế bào sống (không nhuộm màu), cụm đa bào sinh phôi (qua nhuộm màu) (ở giai đoạn ~ 10 ngày nuôi lỏng lắc mô sẹo có khả năng sinh phôi) dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 50X, 20X, theo thứ tự.
2.3.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm)
Thí nghiệm này nhằm tạo nguồn vật liệu mô sẹo cho sự khảo sát tạo phôi sau đó. Vật liệu nuôi cấy được sử dụng là mảnh lá có kích thước 3 x 10 mm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Mẫu được cấy trên môi trường tạo mô sẹo là SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L, 30 g/L sucrose. Tiến hành cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo, mô sẹo có KNSP ở thời điểm 30 NSC.
Tạo phôi
Vật liệu nuôi cấy: mô sẹo hình thành từ thí nghiệm 2.3.2.2
Mẫu mô sẹo được cấy vào môi trường tạo phôi giống môi trường nuôi cấy của thí nghiệm tạo phôi ở môi trường đặc. Tiến hành cấy 5 mẫu mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi, quan sát sự hình thành phôi; thu thập số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu: số mẫu mô sẹo tạo phôi, số phôi/mẫu mô sẹo. Tiếp tục quan sát, ghi nhận sự phát triển của phôi ở giai đoạn 60 NSC (không thu thập số liệu).
2.3.3. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Phôi vô tính được xác định là một trong bốn dạng hình thái phát triển của phôi: dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, dạng phôi trưởng thành (dạng phân cực có tiền lá mầm và tiền rễ). Đếm phôi bằng cách quan sát dưới kính lúp và ghi nhận số phôi.
Tiến hành lấy chỉ tiêu theo dõi với 30 mẫu cho mỗi nghiệm thức.
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phôi trực tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 60 sau cấy:
Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) = (Số mẫu tạo phôi/số mẫu cấy) x 100% Số phôi/mẫu = Tổng số phôi/số mẫu tạo phôi
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phôi gián tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 30 sau cấy:
Số cụm mô sẹo có KNSP/mẫu = 𝑆ố 𝑐ụ𝑚 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃
𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃
Số phôi/cụm mô sẹo = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑝ℎô𝑖
𝑆ố 𝑐ụ𝑚 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑡ạ𝑜 𝑝ℎô𝑖
2.4. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính
2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc
Vật liệu nuôi cấy là các cụm phôi vô tính sơ cấp (hình thành từ mảnh lá). Môi trường nhân phôi được sử dụng từ kết quả của thí nghiệm tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá về môi trường khoáng, loại auxin, nồng độ BA. Loại auxin này được sử dụng với các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/L), 30 g/L sucrose. Thí nghiệm được bố trí trên các đĩa petri, theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Cấy 5 cụm phôi/đĩa (3 phôi/cụm), 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về số phôi/cụm phôi, hệ số nhân phôi, quan sát đặc điểm hình thái phôi, cụm phôi ở 30 NSC. Chú ý quan sát sự hình thành phôi thứ cấp ở các bộ phận (từ thân, lá, rễ) của phôi sơ cấp.
2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng
2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc nuôi lỏng lắc
Sử dụng kết quả của thí nghiệm trên làm cơ sở cho thí nghiệm khảo sát tác động của các chất ĐHST đến sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường lỏng. Do đó, môi trường nuôi cấy được kế thừa về môi trường khoáng, các mức nồng độ của loại auxin có phát sinh phôi tích cực và nồng độ BA; nuôi cấy lỏng lắc. Sử dụng máy lắc hiệu SARTORIUS của Đức, thực hiện nuôi lỏng lắc với 80 vòng/phút.
Vật liệu nuôi cấy là các phôi đơn 60 ngày tuổi (từ thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá).
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác V250 mL, chứa 60 mL môi trường nuôi cấy, nuôi lỏng lắc 80 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 30 phôi/bình. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái và màu sắc phôi ở 30 NSC.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi phôi
Vật liệu nuôi cấy: sử dụng phôi qua nuôi cấy lỏng lắc sau 60 ngày nuôi cấy từ phôi 60 ngày tuổi của các thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.
Để khảo sát ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, sử dụng khối lượng phôi ban đầu như sau: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi cấy kế thừa thí nghiệm ảnh hưởng chất ĐHST, 30 g/L đường. Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái phôi/cụm phôi ở 30 NSC.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi
2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp
Sử dụng vật liệu là các phôi vô tính với các kích thước khác nhau: kích thước nhỏ (7 - 8 mm), trung bình (~ 10 mm), to (~ 15 mm). Tiến hành cấy 30 phôi nhỏ/trung bình/to vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi cấy giống thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy, có 30 g/L đường.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi hình thành ở 30 NSC.
2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phôi 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường như thí nghiệm trên, sucrose được khảo sát với các mức nồng độ (20, 30, 40, 50 g/L); mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về khối lượng