5. Tính mới của đề tài
1.4.2. Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định
Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến các giai đoạn hình thành rễ bất định bao gồm chất ĐHST, thành phần môi trường khoáng, nguồn carbon, mật độ mô/tế bào nuôi cấy, độ pH,.. Các loại môi trường nuôi cấy khác nhau có tác dụng khác nhau đối với cảm ứng phân nhánh và gia tăng sinh khối rễ. MS, ½MS là môi trường thích hợp trên nhiều đối tượng cây trồng như Boesenbergia rotunda, Vernonia amygdalina, Camellia sinensis và Echinacea purpurea.
Nguồn carbon cần thiết cho sự hình thành rễ cũng khác nhau do khả năng hấp thụ của từng loài thực vật và quá trình chuyển hóa nguồn carbon có khác nhau. Nồng độ đường 50 g/L là rất thích hợp cho Boesenbergia rotunda và Eurycoma longifolia, trong khi nồng độ đường 30 g/L thích hợp đối với Camellia sinensis... Ngoài ra, nồng độ đường thích hợp cũng ảnh hưởng đến việc tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp. Nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy rễ Gynura procumbens, các môi trường MS (½ - 2), nồng độ đường (1 – 10%), độ pH (5 - 6,5), và điều kiện tối/sáng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy đường 2% là thích hợp nhất cho sự tăng trưởng rễ. Dựa trên nghiên cứu của Cui và cộng sự (2010), nồng độ cao của đường (5%, 7%, 9%) đã ảnh hưởng đến sinh khối do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu - là rất cao. Hơn nữa, trong nghiên cứu nuôi rễ Psammosilene tunicoide với các điều kiện nuôi cấy như nồng độ đường (0 - 50 g/L); các chu kỳ sáng (0 - 12 h/ngày); pH ban đầu (5 - 6,5); và cường độ ánh sáng 2.000 lux, kết quả cho thấy các yếu tố ảnh hưởng thích hợp là 30 g/L đường, chu kỳ sáng 10 h/ngày, và pH ban đầu là 5,8 [100].
Ahkami và cộng sự (2013) đã nghiên cứu vai trò của sự di chuyển phân cực của auxin đối với sự tích tụ auxin và sự hình thành rễ bất định ở đoạn thân mang chồi của Petunia hybrida. Sau cắt và trồng đoạn thân trong khay nhựa, nhận thấy IAA tăng lên ở gốc đoạn thân và đạt đỉnh cao ở thời điểm 2 h và 24 h, giảm mạnh ở ở 48 h và giảm tối đa ở thời điểm 192 h. Xử lý Naphthylphthalamic acid (NPA) (chất ức chế vận chuyển auxin) đã gây ức chế tạo đỉnh IAA ở 24 h dẫn đến ức chế hoàn toàn sự tạo rễ. Các tác giả trên kết luận sự phát sinh rễ bất định ở Petunia phụ thuộc vào (1) Sự vận chuyển phân cực của auxin, và (2) Đỉnh IAA ở thời điểm 24 h ở vùng tạo rễ
thời điểm 24 h tạo thuận lợi cho quá trình phát triển tiếp theo của rễ. Sự phát triển tiếp theo của rễ kích thích sự đường phân và hoạt động của con đường pentose phosphate – giúp tạo năng lượng, khung carbon dùng sinh tổng hợp acid amin, protein và acid nucleic ở các tế bào trong quá trình tăng sinh, biệt hóa và tăng trưởng [101].
Guan và cộng sự (2019) đã nghiên cứu vai trò điều hòa của auxin đối với quá trình tạo rễ bất định từ đoạn thân mang chồi (~ 4 cm) dòng cà chua Alisa Craig (AC) và dòng chuyển gen DR5pro:YFP trans nuôi trong dung dịch dinh dưỡng Hoagland. Kết quả cho thấy rễ bất định bắt nguồn từ tế bào nguồn ở lớp tế bào trụ bì của đoạn thân. Sau đó rễ bất định kéo dài sau quá trình chết của tế bào biểu bì. Mức auxin và ethylene tăng lên ở phần gốc đoạn thân trong vòng 1 h, có sự phân bố auxin gia tăng ở pha khởi tạo rễ, tập trung ở mô phân sinh đang phát triển; ngược lại, zeatin, acid salicylic và acid abscisic chỉ đóng vai trò nhỏ trong quá trình tạo rễ. Các tác gỉả trên còn ghi nhận sự biểu hiện của gen vận chuyển auxin đặc hiệu tăng lên trong suốt pha phát triển của rễ [102].
Guan và cộng sự (2020) đã nghiên cứu sự di chuyển phân cực của auxin thông qua sự tạo rễ bất định từ đoạn thân của giống táo lùn (Malus domestica) M.9. Các tác giả cho rằng sự hình thành rễ bất định bắt đầu bằng sự phân chia và kéo dài của các tế bào nguồn – là tế bào tượng tầng đã phản biệt hóa, ở vị trí gần kề hai bó mạch, quá trình này xảy ra ở điều kiện có mức tương đối cao của IAA trong mô và có sự phân giải các hạt tinh bột dùng cung cấp năng lượng. Auxin ngoại sinh đã kích thích sự phân chia tế bào, sự tăng sinh và tái cấu trúc hệ võng nội chất và thể golgi. Ngược lại, ở nghiệm thức xử lý N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) - tác nhân gây ức chế sự di chuyển auxin, nhận thấy có hiện tượng ức chế sự phân chia tế bào ở vùng gốc của đoạn thân dẫn đến sự phân bào bất thường ở suốt giai đoạn sớm của quá trình hình thành rễ [13].
Auxin là chất ĐHST có tính quyết định đối với nuôi cấy rễ bất định, một số auxin thường được sử dụng là IAA, IBA, NAA, kể cả 2,4-D. Hiệu quả đến tăng trưởng rễ khá phụ thuộc vào loài thực vật. Dựa trên các báo cáo khác nhau cho thấy IBA là auxin thích hợp để cảm ứng và phát triển nuôi cấy rễ của một số cây thuốc/cây trồng như Centella asiatica, Costus igneus, Couroupita guianensis Aubl., Labisia pumila, Psoralea coryfolia, Silyabum marianum. Nồng độ IBA 7 m/L; 0,5 mg/L là nồng độ tối ưu cho sự hình thành rễ bất định so với NAA/IAA ở Centella asiatica,
Costus igneus, theo thứ tự. Bên cạnh IBA, NAA cũng có ảnh hưởng mạnh đến cảm ứng và gia tăng sinh khối rễ. NAA là auxin tốt nhất đối với nuôi cấy rễ nhiều loài như
Andrographis paniculata, Boesenbergia rotunda, Eurycoma longifolia, Fagonia indica, Mondia whitei, và Rumex crispus. Trong nghiên cứu nuôi cấy rễ cây thuốc
Andrographis paniculata, NAA ở nồng độ 2,7 µM tạo sinh khối rễ khô/tươi và hàm lượng andrographolide cao sau 4 tuần nuôi cấy so với IAA và IBA. Đối với Rumex crispus, 5 µM NAA là nồng độ rất thích hợp để tạo và tăng sinh rễ. Trong khi đó, nồng độ cao hơn, 10 µM NAA - tối ưu cho nuôi cấy rễ của Mondia whitei. So với IBA và NAA, IAA có hiệu quả thấp trong thúc đẩy phát triển rễ cây thuốc, trừ ở trường hợp Orthosiphon stamineus (nồng độ 3 mg/L là tốt nhất để thúc đẩy sự ra rễ từ mẫu cấy lá). Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng cho rằng IBA và NAA có thể được kết hợp với nhau để tạo ra các điều kiện tăng trưởng tối ưu cho nuôi cấy rễ cây thuốc. Ví dụ, sự kết hợp 1 mg/L IBA và 1 mg/L NAA rất thích hợp cho rễ Luffa acutangula
(L.) Roxb. và sự kết hợp của 0,05 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA là điều kiện tối ưu cho rễ Psammosilene tunicoides [98]. Ở họ Ngũ gia bì, cũng nhận thấy có sự đa dạng về loại môi trường, loại và nồng độ chất ĐHST,.. sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ. Ví dụ rễ bất định Panax notoginseng tái sinh tốt từ mô cuống lá, đoạn rễ nhánh nuôi cấy trên môi trường MS có 3 mg/L IBA, có hoặc không bổ sung kinetin; nuôi lỏng lắc rễ bất định được thực hiện trong môi trường ½MS có 3 mg/L IBA [44]. Đối với tạo rễ bất định thứ cấp từ rễ bất định sơ cấp Panax vietnamensis, rễ thứ cấp phát triển tốt nhất trên môi trường MS cải biên (½NH4+/NO3-) có IBA và BA, 30 g/L đường, ở 22oC và pH 5,3 [47]. Li và cộng sự (2004) đã tạo rễ cho các chồi (có nguồn gốc từ đốt thân) Scheffleraoctophylla qua sử dụng môi trường ½MS có bổ sung chất ĐHST thích hợp là NAA (0,2 mg/L). Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA sử dụng để tái sinh rễ bất định Panaxstipuleanatus từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân rễ [43].
Lo (1997) cũng nghiên cứu sự tái sinh rễ bất định Saintpaulia ionantha
(African violet) đồng thời với nghiên cứu tái sinh chồi từ mảnh lá theo cơ chế phát sinh cơ quan dưới ảnh hưởng của một số yếu tố như tuổi sinh lý, tạo vết thương, cách đặt mẫu cấy vào môi trường và sự trao đổi khí. Kết quả thu được cho thấy rễ bất định có nguồn gốc từ tế bào nhu mô diệp lục khuyết [103].
giai đoạn mô sẹo chỉ mới bắt đầu hình thành. Khảo sát mô tế bào cho thấy, sau nuôi cấy, có các lớp tế bào khác biệt hình thành từ bó mạch của mảnh lá và từ đây sơ khởi rễ và tế bào mô mạch mới hình thành. Như vậy, các tế bào có nguồn gốc mô mạch (VDC) lá tương tự như tế bào tiền tượng tầng và có chức năng của tế bào gốc, qua đáp ứng với auxin ngoại sinh sẽ có xu hướng tạo tế bào mô phân sinh sơ khởi rễ và mô mạch của rễ mới hình thành (kết quả đã được chứng minh qua sử dụng đột biến sickle ‘skl’ – bị hư hại ở khả năng truyền tín hiệu ethylene trong khi dòng hoang dại và dòng đột biến ‘sunn’ - khiếm khuyết ở chức năng di chuyển phân cực của auxin). VDC có thể có nguồn gốc từ mô libe hoặc gần mô libe [104].
Qua các thông tin cho thấy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã và đang có nhiều đóng góp trong lĩnh vực nghiên cứu thực vật ở khía cạnh sinh lý. Cơ sở khoa học của phương pháp này là tính toàn thế của tế bào. Qua nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, tế bào có thể phát triển qua nhiều bước tiếp theo thành các cấu trúc mới như phôi vô tính/chồi/rễ và thành cây hoàn chỉnh theo hình thức tái sinh trực tiếp hoặc gián tiếp. Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo các sản phẩm mục tiêu như phôi/chồi/rễ như vai trò sinh lý của chất ĐHST, tuổi sinh lý mẫu cấy, điều kiện nuôi cấy, kiểu gene thực vật,… Theo nhiều tài liệu, trong các nhóm chất ĐHST, auxin là tác nhân đóng vai trò quan trọng của quá trình tái lập trình để tế bào sinh dưỡng (ở trạng thái biệt hóa hoặc phản biệt hóa) chuyển sang trạng thái mang tính toàn thế (founder cell) - hướng đích tạo phôi vô tính hoặc rễ bất định. Phương pháp khảo sát hình thái/hình thái giải phẫu mô tế bào với đối tượng nghiên cứu là các loại mô/tế bào, hình thức tổ chức và phát triển của chúng cũng đã góp phần quan trọng trong tìm hiểu về tính toàn thế của tế bào.
Tóm lại, các thông tin tổng quan nêu trên đã khái quát tầm quan trọng của một số loài thực vật quan trọng thuộc họ Ngũ gia bì nói chung và NGBCC nói riêng, trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học và thực tiễn cuộc sống. Như đã trình bày, điểm tồn tại/hạn chế hiện nay là các nghiên cứu liên quan đến xây dựng hai hệ thống nuôi cấy là phôi vô tính và rễ bất định - vốn có rất nhiều ưu điểm còn rất hạn chế trên đối tượng thực vật này. Do vậy, đề tài này với nội dung triển khai thực nghiệm nghiên cứu tạo và nhân sinh khối phôi vô tính và rễ bất định hy vọng sẽ góp phần phát triển hướng nghiên cứu quan trọng này, đồng thời cung cấp một số dẫn liệu khoa học mới về hai hệ thống nêu trên.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP