5. Tính mới của đề tài
3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá
mô lá
Phân tích số liệu (Bảng 3.2) cho thấy, môi trường nuôi cấy có NAA được bổ sung BA với các mức nồng độ (0,25; 0,5; 1 mg/L) thì kết quả tạo phôi có khác biệt về thống kê giữa các nghiệm thức. Điều đó chứng tỏ, sự kết hợp của NAA và BA có ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi. Nhận thấy, khi sử dụng BA (0,25; 0,5; mg/L) kết hợp với NAA (3, 4, 5 mg/L) mô lá có biểu hiện đáp ứng tích cực, các chỉ tiêu theo dõi đều cao hơn khi môi trường nuôi cấy bổ sung auxin (NAA) riêng lẻ, không kết hợp với BA, cụ thể tỷ lệ mẫu cấy tạo phôi và số phôi/mẫu tăng, cao nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA kết hợp với 0,25 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi là 94,44% và 28,56 phôi/mẫu), cao hơn nghiệm thức đối chứng 5 mg/L NAA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 88,89% và 19,95 phôi/mẫu). Nhưng các nghiệm thức có NAA (3, 4, 5 mg/L) khi bổ sung 1 mg/L BA, thì mẫu cấy tạo phôi chậm, tỷ lệ tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm, thấp nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA và 1 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 57,78% và 9,67 phôi/mẫu). Như vậy, khi bổ sung BA với nồng độ tối ưu đã phát huy vai trò của NAA trong quá trình phân bào và phát sinh phôi vô tính trực tiếp với hiệu quả
cao nhất. Từ kết quả trên cho thấy, sự hiện diện của auxin (NAA) kết hợp với cytokinin (BA) là cần thiết cho quá trình phát sinh phôi NGBCC, sự tương tác này có tác động tích cực và hiệu quả khi nồng độ của chất ĐHST thích hợp (Hình 3.4D,E).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC. NAA (mg/L) BA (mg/L) Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) Số phôi/mẫu 3 0 71,11g* 11,27h 4 0 78,89e 15,24e 5 0 88,89c 19,95b 3 0,25 75,56f 15,78e 4 0,25 82,22d 18,83c 5 0,25 94,44a 28,56a 3 0,5 72,22g 12,67g 4 0,5 80,00e 18,00d 5 0,5 91,11b 20,67b 3 1 67,78h 10,67i 4 1 65,56i 14,33f 5 1 57,78j 9,67j
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥
khi phân tích thống kê.
Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phôi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào, và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy, do vậy cũng có vai trò quan trọng trong tạo phôi [82]. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phôi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phôi như đã nêu trên.
Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA và BA, 60 NSC.
A,B,C. Môi trườngSHcó 4 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L; D,E,F. Môi trường SHcó 5 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L. Thanh ngang 5 mm.
Kết quả tác động tích cực của BA đối với sự hình thành phôi NGBCC ở nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a) khi bổ sung thêm kinetin/BA (0,25 – 5 mg/L) vào môi trường dùng tạo phôi Panax pseudoginseng [71]. Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phôi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với auxin kích thích sự phân bào và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy và do vậy cũng có vai trò quan trọng trong tạo phôi [82]. Từ nuôi cấy mảnh lá mầm phôi hợp tử Cucumis sativa trên môi trường có BA ở điều kiện chiếu sáng, Li và cộng sự (2007) nhận thấy BA, ngoài tác động làm tăng kích thước mảnh lá mầm cũng đã làm tăng hàm lượng cytokinin nội sinh [5]. Qua nghiên cứu mối liên quan giữa hàm lượng chất ĐHST nội sinh với các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi vô tính từ nuôi cấy mô phôi hợp tử Ormosia henryi, Gaoyin và cộng sự (2020) [12] nhận thấy hàm lượng auxin đạt cao ở giai đoạn phát triển và sự phân cực của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs cao), và hàm
lượng cytokinin cũng cao ở giai đoạn trưởng thành và nẩy mầm của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs giảm).
Như vậy, chất ĐHST ngoại sinh có vai trò không thể thay thế trong cảm ứng tạo phôi vô tính và nồng độ của chúng ảnh hưởng đến sự cân bằng chất ĐHST nội sinh trong đó có cytokinin, giúp điều hòa sự tăng trưởng và phát sinh hình thái. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phôi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo phôi như đã nêu trên.