5. Tính mới của đề tài
3.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ
Ở thí nghiệm này, các rễ sơ cấp đơn (20 ngày tuổi, có nguồn gốc từ nuôi cấy mảnh lá) sử dụng làm vật liệu nuôi cấy (Hình 3.49)
Hình 3.49. Vật liệu rễ bất định sơ cấp ở 20 NSC
A. Rễ đơn; B. Cụm 2 rễ; C. Cụm 3 rễ; D. Cụm 4 rễ (vạch ngang và dọc chỉ vị trí cắt thu rễ đơn, thanh ngang 1 cm).
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ, ở môi trường ½MS, 21 NSC. Nồng độ (mg/L) Chiều dài RSC (mm) Số RN cấp 1 Chiều dài RN cấp 1 (mm) Số RN cấp 2
Đặc điểm hình thái, màu sắc rễ
NAA 1 18,20 d* 10,36b 3,40c 0,20c RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có lông hút, rễ màu trắng xám.
2 19,72c 12,44a 3,90b 7,20b RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có lông hút, rễ màu trắng xám. Có sự hình thành RN cấp 2.
3 20,11c 12,95a 4,20a 7,33a RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có lông hút; gốc, thân rễ sơ cấp và đầu RN bị phù, rễ màu trắng xám. Có sự hình thành RN cấp 2. IBA 1 15,33e 2,62e 2,00e 0,10e RN cấp 1 nhỏ, dài; đầu RN thon,
không có lông hút, rễ màu hơi vàng.
2 21,11b 4,43d 3,00d 3,33d RN cấp 1 nhỏ, dài, không có lông hút, rễ màu hơi vàng. Có sự hình thành RN cấp 2
3 22,43a 5,20c 3,00d 3,60c RN cấp 1 nhỏ, dài, không có lông hút; gốc và thân rễ sơ cấp bị phù, rễ hơi vàng. Hình thành RN cấp 2
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
Kết quả (Bảng 3.22) cho thấy, nói chung rễ trong môi trường không bổ sung NAA/IBA (đối chứng) không có khả năng phân nhánh (do vậy không đưa số liệu và bảng), rễ nhánh trong môi trường có bổ sung NAA hình thành tốt hơn so với rễ trong môi trường có IBA ở cả ba chỉ tiêu là số rễ nhánh cấp 1, cấp 2 và chiều dài rễ nhánh cấp 1 ở 20 NSC. Lông hút rễ bị thoái hóa trong môi trường có IBA. Ở môi trường có 3 mg/L NAA, số rễ nhánh cấp 1 là cao nhất - 12,95 so với số rễ trong hai môi trường có 1 mg/L, 2 mg/L NAA lần lượt là l0,36; 12,44. Đối với hai chỉ tiêu số RN cấp 1 và
cấp 2, các giá trị ghi nhận được ở hai nghiệm thức 2 mg/L và 3 mg/L là tương đương nhau. Ở các nghiệm thức IBA, số RN cấp 1 ở nghiệm thức 3 mg/L là cao nhất – 5,20. Tuy nhiên, thực tế cho thấy rễ trong môi trường có NAA và IBA với 3 mg/L đều có hiện tượng phù ở gốc rễ (Hình 3.50C,H); riêng ở trường hợp 3 mg/L NAA, cũng ghi nhận được hiện tượng phù ở các đầu rễ (Hình 3.50C). Do vậy, nồng độ 2 mg/L NAA/IBA được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thời gian nuôi lâu hơn, 30 NSC và 45 NSC, ở cả hai nghiệm thức NAA/IBA (2 mg/L), rễ phân nhánh nhiều hơn (Hình 3. 50D,I) và bước đầu hình thành dạng rễ cụm (Hình 3.50E,J), theo thứ tự.
Hình 3.50. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến hình thành rễ nhánh từ rễ đơn, ở môi trường lỏng ½MS.
A,B,C. Hình thành rễ nhánh ở môi trường có 1, 2, 3 mg/L NAA, ở 20 NSC; D. Rễ nhánh dài ở môi trường có 2 mg/L NAA, 30 NSC; E. Cụm rễ nhỏ hình thành ở môi trường có 2 mg/L NAA, 40 NSC; F,G,H. Hình thành rễ nhánh ở môi trường có 1, 2, 3 mg/L IBA, NSC; I. Rễ nhánh dài ở môi trường có 2 mg/L IBA, 30 NSC; J. Cụm rễ nhỏ hình thành ở môi trường có 2 mg/L IBA, 45 NSC (Mũi tên chỉ lên: RN cấp 1, mũi tên chỉ ngang: RN cấp 2, thanh ngang 0,5 cm).
Quá trình phân nhánh dẫn đến tăng trưởng sinh khối trong môi trường có NAA/IBA tạo thành cụm rễ to (Hình 3.51 A,B,C,D,E,F). Các cụm rễ to tiếp theo được nhân lên trong cùng môi trường nhằm thu vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình
Hình 3.51. Rễ tăng trưởng sinh khối liên tụcqua quá trình phân nhánh của rễ đơn.
A,B. Bình rễ sơ cấp nuôi trong môi trường có 2 mg/L NAA, 2 mg/L IBA, 20 NSC
(thanh ngang 2 cm); C,D. Rễ đơn phân nhánh tạo cụm, sau cấy chuyền, 30 NSC,
(thanh ngang 1 cm); E,F. Cụm rễ to, sau cấy chuyển, 60 NSC (thanh ngang 2 cm);
G,H. Rễ được nhân sinh khối, sau cấy chuyền, 60 NSC (thanh ngang 2 cm).
Trong nuôi cấy in vitro, khả năng nhân rễ bất định phụ thuộc vào việc bổ sung auxin (loại và nồng độ) vào môi trường nuôi cấy [98] trong đó các auxin như IBA và NAA được sử dụng phổ biến ở dạng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau; ngoài ra, nhân rễ còn phụ thuộc vào yếu tố quan trọng khác là họ/ loài thực vật nghiên cứu [198]. Tác động lắc cơ học tạo điều kiện cho mô hấp thu chất ĐHST, chất dinh dưỡng, nước,… đồng đều (không tạo gradient phân bố), trao đổi khí đều hơn, khác với trường hợp mô nuôi cấy trên môi trường đặc [142]. Đáp ứng phân nhánh của rễ trong nuôi cấy mang tính quyết định đối với tăng trưởng sinh khối [184]. Hiện tượng phù ở gốc rễ hoặc/và đầu rễ trong trường hợp dùng NAA, IBA với nồng độ 3 mg/L ở nghiên cứu này, theo chúng tôi, sẽ dẫn đến giảm năng suất sinh khối rễ tương tự như kết quả ghi nhận được ở nuôi lỏng rễ Cichorium intybus [184]. NAA được ghi nhận là thích hợp trong kích thích phân nhánh rễ đối với khá nhiều loài cây dược liệu như
Andrographis paniculata [199], Eurycoma longifolia [181]. NAA 1 mg/L, 2 mg/L là các nồng độ tối ưu cho nhân rễ Fagonia indica [200], rễ Boesenbergia rotunda [195], theo thứ tự. IBA cũng rất thích hợp cho nuôi cấy rễ bất định; nhận thấy 2 mg/L IBA là nồng độ tối ưu cho phát triển sinh khối rễ khá nhiều loài cây dược liệu như Vernonia amygdalina [185]. Ở NGBCC, kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này phù hợp với kết quả công bố của một số tác giả đã sử dụng 2 mg/L NAA/IBA như đã nêu trên để nhân rễ thông qua hiện tượng tạo rễ nhánh.
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ
Kết quả (Bảng 3.25) cho thấy trong môi trường có NAA, khối lượng tươi rễ rễ đạt giá trị cao 2,10 g; 2,16 g lần lượt ở hai nghiệm thức có 30 g/L; 40 g/L sucrose; hệ số nhân tương ứng là 7,00 và 7,20; tuy nhiên các giá trị sinh khối và hệ số nhân giữa hai nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khối lượng rễ, hệ số nhân thấp nhất lần lượt là 1,62 g; 5,40 ở nghiệm thức 20 g/L sucrose. Tương tự ở môi trường có IBA, khối lượng tươi đạt 1,80 g; 1,86 g lần lượt ở hai nghiệm thức 30 g/L, 40 g/L sucrose; hệ số nhân tương ứng là 6,00; 6,21 – cao hơn so với nghiệm thức 30 g/L sucrose (1,45 g; 4,85). Do vậy, 30 g/L sucrose được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi trường ½MS, 30 NSC. Chất ĐHST Nồng độ sucrose (g/L) KLT rễ thu nhận (g) Hệ số nhân sinh khối (lần)
Đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ
NAA 20 1,62c* 5,40c Rễ nhỏ, có lông hút; cụm rễ màu trắng xám, mềm
30 2,10a 7,00a Rễ to, có lông hút; cụm rễ màu trắng xám, mềm
40 2,16a 7,20a Rễ to, có lông hút; cụm rễ màu trắng xám, mềm
IBA 20 1,45d 4,83d Rễ nhỏ, không có lông hút; cụm rễ màu hơi vàng đục, cứng 30 1,80b 6,00b Rễ to, không có lông hút; cụm rễ
màu hơi vàng đục, cứng
40 1,86b 6,20b Rễ to, không có lông hút; cụm rễ màu hơi vàng đục, cứng
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
Có sự khác biệt về hình thái, màu sắc rễ/cụm rễ nuôi trong môi trường có NAA, IBA. Nói chung, ở cả hai trường hợp môi trường có NAA, IBA với nồng độ sucrose
trên, rễ ở môi trường bổ sung NAA có nhiều lông hút ở phần đầu rễ; ngược lại, lông hút rễ khó quan sát ở môi trường có IBA; cụm rễ ở môi trường bổ sung NAA có màu trắng xám, cụm rễ ở môi trường chứa IBA có màu hơi vàng đục (Hình 3.52).
Hình 3.52. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến tăng trưởng sinh khối rễ ở môi trường ½MS, 30 NSC.
A,B,C. Cụm rễ nuôi ở môi trường ½MS bổ sung 2 mg/L NAA, có sucrose 20, 30, 40 g/L; D,E,F. Cụm rễ nuôi ở môi trường bổ sung 2 mg/L IBA, có sucrose 20, 30, 40 g/L. Thanh ngang 2 cm.
Ngoài môi trường khoáng và chất ĐHST, sự tăng trưởng của rễ bất định còn chịu ảnh hưởng của đường - nguồn carbon quan trọng trong trao đổi chất nhằm tăng sinh khối thông qua sự hình thành rễ nhánh và nồng độ sử dụng thích hợp tùy thuộc vào loài thực vật. Theo nhiều tài liệu, nồng độ đường sử dụng dao động từ 20 - 50 g/L, trường hợp cao hơn thường tạo áp suất thẩm thấu bất lợi cho tăng trưởng rễ [100]. Nồng độ đường 20 g/L là tối ưu đối với nuôi rễ Gynura procumbens [182], 30 g/L thích hợp cho nuôi rễ khá nhiều loài thực vật như Hypericumperporatum [100]. Nồng độ đường sucrose khá cao (50 g/L) lại thích hợp cho nuôi lỏng rễ bất định Eurycoma longifolia [181], rễ Boesenbergia rotunda [195]. Rễ NGBCC tăng trưởng tốt trong môi trường có 30 g/L sucrose - phù hợp với kết quả công bố của một số tác giả trên. Ngoài ra, nồng độ đường khác nhau còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp đối với cây dược liệu [98], do vậy kết quả này cũng tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo về hợp chất thứ cấp ở rễ NGBCC.