Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Mồi xuôi (10µM) 0,5 Mồi ngược (10µM) 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng số 25,0
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC TGG CAA TTT GAA TG-3’ PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’ CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’ CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho virus Tai xanh (PRRSV)
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho virus Dịch tả lợn cổ điển (CSFV)
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 43 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 3.6.6.3. Phương pháp điện di sản phẩm RT-PCR
1. Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị gel: Hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
• Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA marker.
• Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
• Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.6.7. Phương pháp PCR
3.6.7.1. Tách chiết DNA virus bằng Kit QIAgen
Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml, thêm 100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl. Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15 giây. Ủ ở 560C trong 10 phút.
Bước 3: Thêm 200µl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây. Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin,
ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini
spin, thêm 500µl Buffer AW1 và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini
spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần dung
dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số, ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng 3.3: Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) Go taq Green 12.5 Mẫu DNA 5 Mồi xuôi (10µM) 0.5 Mồi ngược (10µM) 0.5
Nước khử ion (DEPC – treated) 6
Tổng thể tích 25
Cặp mồi được sử dụng cho phản ứng này tương ứng với từng bệnh cần chẩn đoán:
PCV2F: 5’- GAA GAA TGG AAG AAG CGG-3’; PCV2R: 5’ - GTC ACA GCA GTA GAC AGG T-3; Chu kỳ của phản ứng nhiệt PCR cho PCV2.
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 48 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 2 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.6.7.3. Phương pháp điện di sản phẩm PCR (các bước tiến hành giống với
Phương pháp điện di sản phẩm RT-PCR đã trình bày ở trên)
3.6.8. Phương pháp Realtime PCR
- Tách chiết DNA bằng Kit QIAgen (đã trình bày ở trênphần 3.5.7.1)
- Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) Nước 4.3 2X Reaction buffer 7.5 Mẫu DNA 2 Mồi xuôi (40µM ) 0.3 Mồi ngược (40µM ) 0.3
Enzyme 0.3
Đầu dò (25µM) 0.3
Tổng thể tích 15
Các cặp mồi và đầu dò được sử dụng cho phản ứng này bao gồm:
STT Tên mồi Trình tự (5'-3')
1 Mồi xuôi CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA
2 Mồi ngược GATACCACAAGATCRGCCGT
3 Đầu dò FAM- CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy Realtime PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1
2 Duỗi mạch 95 15 giây
45
Gắn mồi 60 45 giây
-Cách đọc kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu được coi là dương tính khi có Ct ≤ 35; Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct;
Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35, trường hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác để khẳng định.
3.6.9. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. GÂY NHIỄM CHỦNG VIRUS VNUA – ASFV – 02HY CHO LỢN THÍ NGHIỆM NGHIỆM
4.1.1. Kết quả phát hiện kháng thể kháng virus DTLCP của lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm
Trước khi gây bệnh thực nghiệm cho lợn với chủng virus VNUA – ASFV – 02HY, tất cả các lô lợn thí nghiệm đều được tiến hành kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng virus DTLCP. Kết quả trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả hàm lượng kháng thể kháng virus DTLCP của lợn thí nghiệm bằng phương pháp ELISA
Lô Số lợn thí nghiệm Giá trị X% Kết quả
Lô thí nghiệm (n=4) TN 1 19 Âm tính TN 2 28 Âm tính TN 3 12 Âm tính TN 4 13 Âm tính Lô ĐC (n=2) ĐC 1 11 Âm tính ĐC 2 19 Âm tính
Ghi chú: Giá trị X% ≥50: Dương dính; X% <50: Âm tính
Kết quả bảng 4.1 cho thấy xét nghiệm 06 mẫu huyết thanh lợn thí nghiệm bằng phương pháp ELISA đều có giá trị X% < 50, có nghĩa là 06/06 mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể kháng virus DTLCP. Như vậy, 06 lợn đã không nhiễm virus DTLCP.
4.1.2. Kết quả kiểm tra một số virus gây bệnh ở lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm nhiễm
Đồng thời với việc kiểm tra sự tồn tại của kháng thể kháng virus DTLCP bằng phương pháp ELISA, tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus DTLCP và một số virus khác (virus gây bệnh Dịch tả lợn cổ điển (CSFV); virus Circo type 2 (PCV2); virus gây bệnh Tai xanh (PRRV) bằng phương pháp RT – PCR/PCR. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm sự có mặt của một số virusbằng phương pháp Realtime PCR/RT-PCR/PCR Lô TN Bệnh Lợn DTLCP CSFV PRRSV PCV2 Lô TN 1 (n=4) TN 1 - - - - TN 2 - - - - TN 3 - - - - TN 4 - - - - Lô ĐC (n=2) ĐC 1 - - - - ĐC 2 - - - - Ghi chú: (-) Âm tính
Kết quả bảng 4.2 cho thấy toàn bộ lợn thí nghiệm đều cho kết quả âm tính với virus DTLCP, virus gây bệnh Dịch tả lợn cổ điển, virus Circo type 2 (PCV2), virus gây bệnh Tai xanh (PRRS). Điều này có nghĩa 06 lợn thí nghiệm khỏe mạnh, không bị nhiễm các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn.
4.1.3. Kết quả đánh giá thân nhiệt và thể trạngcủa lợn thí nghiệm trước khi gây nhiễm gây nhiễm
Trước khi gây nhiễm, tất cả lợn thí nghiệm được theo dõi thể trạng, kiểm tra thân nhiệt để phát hiện các dấu hiệu bệnh lý bất thường. Kết quả kiểm tra thân nhiệt 7 ngày trước khi gây nhiễm được trình bày ở bảng 4.3.
Kết quả bảng 4.3 cho thấy 6/6 lợn thí nghiệm đều có chỉ số thân nhiệt trong khoảng 37,90C – 39,00C, thân nhiệt nằm giới hạn sinh lý bình thường. Như đã biết, sự ổn định nhiệt độ cơ thể là một điều kiện để đảm bảo cho các phản ứng hoá học được diễn ra bình thường. Với động vật khỏe mạnh, sống trong điều kiện môi trường luôn thay đổi nhưng nhờ có cơ chế điều nhiệt nên nhiệt độ cơ thể luôn được duy trì trong giới hạn sinh lý. Rối loạn điều nhiệt sẽ dẫn đến rối loạn hoạt động chức năng cơ thể (Hoàng Toàn Thắng, 2007). Trong 7 ngày theo dõi lợn sau khi vận chuyển về Khu cách ly, tất cả lợn thí nghiệm đều khỏe mạnh, ăn uống bình thường.
Tổng hợp kết quả lợn không có biểu hiện lâm sàng, huyết thanh học cho kết quả âm tính với kháng thể kháng DTLCP; kiểm tra virus DTLCP và các virus khác đều âm tính. Như vậy, 06 lợn đủ điều kiện để tiến hành gây nhiễm chủng virus DTLCP.
Bảng 4.4. Kết quả đo thân nhiệt trước khi gây nhiễm (0C)
Số Lô Lợn thí nghiệm Ngày theo dõi
1 2 3 4 5 6 7 Lô thí nghiệm (n=4) TN 1 38,0±0,06 38,4±0,09 38,5±0,08 38,1±0,06 38,4±0,09 38,3±0,08 38,3±0,08 TN 2 38,2±0,10 38,2±0,05 38,6±0,02 38,2±0,10 38,1±0,05 38,0±0,02 38,6±0,02 TN 3 38,4±0,08 38,5±0,09 38,1±0,07 38,4±0,08 38,0±0,09 38,1±0,07 38,0±0,07 TN 4 38,2±0,01 38,0±0,10 37,9±0,02 38,0±0,01 38,3±0,10 38,0±0,02 38,1±0,02 Lô đối chứng (n=2) ĐC1 38,5±0,09 38,2±0,07 38,0±0,03 38,1±0,09 38,1±0,07 38,3±0,03 38,2±0,03 ĐC2 38,5±0,08 38,2±0,10 38,7±0,05 38,5±0,08 38,2±0,10 38,4±0,05 38,1±0,05
4.1.4. Kết quả gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY cho lợn thí nghiệm nghiệm
Gây nhiễm cho 04 lợn thí nghiệm được gây nhiễm bằng đường tiêm bắp gốc tai với liều virus ở 104HAD50 của chủng VNUA - ASFV – 02HY, lấy máu kiểm tra sự có mặt của virus DTLCP ở lợn thí nghiệm sau 24-48h gây nhiễm, kết quả trình bày tại bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả giá trị Ct của phương pháp Realtime PCR trên mẫu máu lợn thí nghiệm sau gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY
Stt Lợn thí
nghiệm 1 dpi Giá trị Ct tại các thời điểm sau gây nhiễmKết quả 2 dpi Kết quả
1 TN1 N/A Âm tính 32,25 Dương tính
2 TN2 N/A Âm tính 33,77 Dương tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 TN3 N/A Âm tính 32,43 Dương tính
4 TN4 N/A Âm tính 34,13 Dương tính
5 ĐC1 N/A Âm tính N/A Âm tính
6 ĐC2 N/A Âm tính N/A Âm tính
Dpi: Day post infection – ngày sau gây nhiễm
Kết quả bảng 4.4 cho thấy 04/04 lợn thí nghiệm sau 48h gây nhiễm đã phát hiện thấy sự có mặt của virus DTLCP trong mẫu máu bằng phương pháp Realtime PCR, giá trị Ct dao động từ 34,13 – 32,25. Điều này chứng tỏ đã gây nhiễm thành công chủng virus VNUA - ASFV – 02HY cho lợn thí nghiệm.
4.2. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN THÍ NGHIỆM SAU GÂY NHIỄM CHỦNG VIRUS VNUA – ASFV – 02HY GÂY NHIỄM CHỦNG VIRUS VNUA – ASFV – 02HY
4.2.1. Thân nhiệt
Sau khi gây bệnh, tiến hành đo thân nhiệt hằng ngày của lợn thí nghiệm vào hai thời điểm cố định trong ngày là 9 giờ sáng và 17 giờ chiều. Sau đó ghi chép lại, xử lý số liệu. Kết quả kiểm tra thân nhiệt của lợn thí nghiệm sau gây nhiễm với chủng virus VNUA – ASFV – 02HY được thể hiện ở bảng 4.5. Lợn sốt nếu thân nhiệt lớn hơn 39,50C.
Qua bảng 4.5 cho thấy, lợn thí nghiệm bắt đầu có biểu hiện sốt nhẹ (39,5 – 40,0oC) sau 2 ngày gây nhiễm, thân nhiệt lợn tăng cao và đạt đỉnh điểm ở ngày thứ 6 và thứ 7 (41,7 – 42,5oC) sau gây nhiễm, sau đó thân nhiệt lợn thí nghiệm giảm và chết. Lợn đối chứng thân nhiệt ổn định (37,9 – 38,8oC).
Theo chúng tôi lợn thí nghiệm sau gây nhiễm có hiện tượng sốt là do virus tấn công vào cơ thể, phá huỷ tế bào và kích thích vào trung khu điều hoà nhiệt, làm rối loạn trung khu điều hoà nhiệt, gây hiện tượng sốt cao, kèm theo đó là hiện tượng mệt mỏi, giảm ăn hoặc bỏ ăn. Lợn đối chứng có nhiệt độ dao động trong phạm vi sinh lý bình thường.
Bảng 4.5. Thân nhiệt của lợnthí nghiệm sau khi gây nhiễm chủng virus VNUA – ASFV – 02HY
Stt Lợn
TN
Thân nhiệt của lợn thí nghiệm (độ C) tại các thời điểm sau gây nhiễm
1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi 6dpi 7dpi 8dpi 9dpi
1 TN 1 38,2 39,7 40,3 40,5 40,9 41,7 42,0 39,1 * 2 TN 2 38,5 39,5 40,5 41,3 41,2 42,5 41,8 38,6 * 3 TN 3 39,0 39,6 39,8 40,8 41,1 * 4 TN 4 37,9 40,0 40,9 41,2 41,0 41,9 39,3 * 5 ĐC 1 38,5 38,6 38,3 38,4 38,0 37,9 38,3 38,4 38,0 6 ĐC 2 38,1 38,2 38,5 38,7 38,1 38,0 38,5 38,8 38,1
Ghi chú: Lợnlô thí nghiệm (TN) và lô đối chứng (ĐC), (*) Lợn thí nghiệm chết. Dpi: Day post infection – ngày sau gây nhiễm
4.2.2. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn được gây nhiễm
Trong quá trình gây bệnh thực nghiệm, chúng tôi tiến hành theo dõi, ghi chép những triệu chứng lâm sàng của lợn. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Triệu chứng lâm sàng của lợn thí nghiệm được gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY
Stt Triệu chứng lâm sàng Số con biểu hiện Tỷ lệ (%)
1 Mệt mỏi 4/4 100
2 Bỏ ăn 4/4 100
3 Biểu hiện thần kinh ¾ 75
4 Nổi xuất huyết trên da ¾ 75
5 Khó thở, suy hô hấp ¾ 75
6 Hậu môn có xuất huyết 2/4 50
7 Chảy nước mũi 2/4 50
Kết quả bảng 4.6 cho thấy lợn thí nghiệm có biểu hiện triệu chứng lâm sàng đặc trưng như bỏ ăn, mệt mỏi, khó thở và xuất huyết ngoài da sau 5 - 6 ngày sau gây nhiễm, đây là triệu chứng điển hình thường gặp lợn mắc bệnh DTLCP ngoài thực địa. Lợn ở lô đối chứng khỏe mạnh bình thường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong số 4 lợn thí nghiệm, lợn thí nghiệm số 3 có mức độ triệu chứng lâm sàng nặng nề nhất. Và lợn thí nghiệm số 3 chết sau 5 ngày gây nhiễm. Lợn thí nghiệm còn lại chết sau 7 và 8 ngày gây nhiễm.
Triệu chứng xuất huyết ngoài da ở vùng tai, hông hoặc toàn thân là triệu chứng điển hình của bệnh DTLCP. Ở thể cấp tính, cơ chế xuất huyết là do sự hoạt hóa đại thực bào bởi sự nhân lên của virus trong giai đoạn cuối của bệnh. Trong thể á cấp tính, hiện tượng xuất huyết chủ yếu là do tăng tính thấm thành mạch.
Lợn có triệu chứng hô hấp như ho, khó thở. Ở thể á cấp tính con vật viêm toàn bộ phổi gây nên các triệu chứng khó thở, ho có đờm, phổi có thể bội nhiễm vi khuẩn kế phát. Giai đoạn cuối của thể cấp tính và á cấp tính phổi có hiện tượng phù thũng ở các thùy (là nguyên nhân gây chết lợn), đây thường là hậu quả của sự hoạt hóa đại thực bào nội mạch ở phổi. Do đó, con vật có triệu chứng ho, khó thở khi mắc bệnh.
Ngoài ra, 02 lợn thí nghiệm số 1 và số 2 có chảy dịch mũi và lợn số 2 có gỉ mắt. Triệu chứng lâm sàng của 4 lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng virus VNUA - ASFV – 02HY tương tự như trong mô tả triệu chứng lợn mắc bệnh DTLCP thể cấp tính tại thực địa (Lê Văn Năm, 2010).
Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới khi cho rằng: lợn mắc bệnh DTLCP ở thể cấp tính thường có triệu chứng sốt, phát ban đỏ và tím tái ở da. Chức năng của các cơ quan nội tạng, toàn bộ hệ tiêu hóa bị suy