Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.6.6.Phương pháp RT-PCR
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.6.Phương pháp RT-PCR
3.6.6.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Các bước tách chiết RNA được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của nhà sản xuất gồm:
1. Lấy 560µl dung dịch AVL có chứa carrier RNA cho vào ống ly tâm 1.5 ml. 2.Thêm 140µl mẫu (huyết tương, huyết thanh, dịch nuôi cấy tế bào, dịch swab) vào ống ly tâm trên. Trộn đều bằng máy votex.
3.Ủ ở nhiệt độ 15 - 200C trong 10 phút.
4.Ly tâm để cho các phần dung dịch trên nắp rơi xuống hết ống nghiệm. 5.Thêm 560µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy votex trong 15giây. Sau đó, spindown toàn bộ dung dịch xuống.
6.Lấy 630µl dung dịch ở bước 5 cho vào ống Qiaamp Mini (dung tích 2ml). Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới.
7.Lặp lại bước 6.
8.Cho 500µl buffer AW1. Đậy nắp, ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ dịch dưới ống.
9. Bổ sung 500µl dung dịch AW2.
10. Ly tâm tốc độ 1400 vòng/phút/ 3 phút. Thu được 60µl dịch chiết RNA tổng số.
11. Bảo quản mẫu RNA ở nhiệt độ -200C.
3.6.6.2. Phương pháp RT- PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA tổng số sau khi tách chiết sẽ được trộn với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Mồi xuôi (10µM) 0,5 Mồi ngược (10µM) 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng số 25,0
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt với cặp mồi:
PRRSVF: 5’-TCC TAC TGG CAA TTT GAA TG-3’ PRRSVR: 5’-CCT TTA GAG CAT ATA TCA TCA C-3’ CSF4F: 5’-CCT GAG GAC CAA ACA CAT GTT G-3’ CSF5R: 5’-TGG TGG AAG TTG GTT GTG TCT G-3’.
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho virus Tai xanh (PRRSV)
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
Chu kỳ của phản ứng nhiệt RT-PCR cho virus Dịch tả lợn cổ điển (CSFV)
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 43 1 phút Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 3.6.6.3. Phương pháp điện di sản phẩm RT-PCR
1. Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE, trong nghiên cứu này sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị gel: Hòa tan 1,2 gam agarose với 100ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng ở 1000C/5 phút. Sau đó đổ vào khuôn có lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
• Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA marker.
• Bước 3: Chạy điện di (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
• Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.