Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.10. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin
3.5.10.1. Phương pháp kiểm tra vô trùng
a. Lấy mẫu:
Việc lấy mẫu được áp dụng theo QCVN 01 - 03: 2009/BNNPTNT: “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về lấy mẫu thuốc thú y để kiểm tra chất lượng”. Lấy mẫu theo lô sản xuất. Đối với vắc xin vô hoạt, quy cách đóng gói cho tới 100ml, số lượng mẫu cần lấy 7-10 mẫu.
b. Kiểm tra vô trùng:
Chỉ tiêu vô trùng được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011. Sử dụng 03 lọ vắc xin/lô sản xuất, đưa vắc xin về nhiệt độ phòng trước khi kiểm tra.
-Chuyển 1ml vắc xin của 03 lọ vắc xin ngẫu nhiên vào ống nghiệm thủy tinh chứa 10ml dung dịch TSB.
-Nuôi tủ ấm 370C trong 3 ngày.
-Huyễn dịch nuôi cấy dùng để cấy chuyển lên các loại môi trường kiểm tra vi khuẩn, nấm mốc và Mycoplasma.
-Cấy huyễn dịch trên vào các môi trường quy định (thạch máu, thạch Marconkey, Thioglycollate, Trypticase Soybean Broth (TSB), thạch Sabouraud), mỗi loại môi trường 2 ống. Các môi trường nêu trên được chế theo quy định thông dụng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí, yếm khí, salmonella và vi khuẩn gây dung huyết có trong vắc xin.
-Lượng vắc xin cấy kiểm tra bằng 1-2% dung tích môi trường
-Môi trường đã cấy kiểm tra được để tủ ấm 370C theo dõi hàng ngày trong 7 ngày. Riêng môi trường kiểm tra nấm (thạch Sabouraud) để ở nhiệt độ 250C, theo dõi hàng ngày trong 14 ngày.
-Để kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma, mẫu vắc xin được cấy kiểm tra trên môi trường nước PPLO (100µl vắc xin trong 10ml môi trường) và đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin trên 1 đĩa (Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein, được bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa hoặc sử dụng môi trường canh thang tim được bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra). Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ 33-370C đối với môi trường dung dịch PPLO. Tại các ngày 3, 7, 10 và ngày 14 lấy canh khuẩn ở môi trường nước ria cấy trên môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Để ở 370C trong tủ CO2 (4-6%) theo dõi trong 28 ngày.
-Mẫu được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
3.5.10.2. Phương pháp kiểm tra hóa lý vắc xin
a. Kiểm tra cảm quan
Đặt lọ vaccine trước của một nền trắng (giấy trắng), bằng mắt thường xác định màu sắc của lọ vaccine trong điều kiện ánh sáng ban ngày. Quan sát trạng thái, màu sắc của mẫu vắc xin.
Mẫu vắc xin đạt tiêu chuẩn có màu trắng ngà, hỗn dịch đồng nhất, không bị phân lớp, không đông vón, không lắng cặn, không có dị vật bất thường.
b. Kiểm tra độ nhớt
-Phương pháp 1: Chuyển vắc xin vào ốc đong nhúng ngập điện cực của máy đo vào cốc vắc xin. Vận hành máy và ghi lại giá trị hiển thị.
-Phương pháp 2: Sử dụng pippet 1ml, có đường kính trên là 2,7mm và dưới là 1,2 mm, hút 1 ml vắc xin và cho chảy xuống tự nhiên theo chiều thẳng đứng, ghi nhận kết quả chảy của 0,4 ml. Nếu dưới 8 giây thì vắc xin n đạt yêu cầu.
c. Kiểm tra độ ổn định
Thực hiện 1 trong ba phương pháp sau:
-Phương pháp 1: Phương pháp Drop test (theo quy trình của hãng SEPPIC): Dùng cốc đong có thể tích 250 ml chứa 200ml nước cất. Nhỏ 1 giọt vắc xin (≈ 3 mg) lên bề mặt nước (chú ý không khuấy). Nếu giọt vắc xin lan nhanh, nổi trên bề mặt nước kể cả khi lắc nhẹ cốc đong thì vắc xin đạt yêu cầu là vắc xin nước trong dầu (water in oil).
-Phương pháp 2: Chuyển mẫu vắc xin vô hoạt nhũ dầu vào ống ly tâm, đem ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Nếu phần nước tách ra ở ở ống ly tâm <0.5ml thì vắc xin được xem là ổn định.
-Phương pháp 3: Kiểm tra độổn định của vắc xin (theo qui trình của hãng SEPPIC): Chia vắc xin vào 2 chai nhựa loại 20 ml rồi đậy chặt nắp, 1 chai bảo quản ở 2- 80C và 1 chai bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 20-250C). Theo dõi sự thay đổi của vắc xin sau 2 tuần, 1 tháng, 6 tháng, 1 năm.
-Vắc xin được coi là đạt tính ổn định khi vắc xin phải trắng và đồng nhất từ trên xuống đáy hoặc có thể có một lớp dầu (<10% thể tích) trên bề mặt hoặc có thể tầng đáy có màu trắng hơn nhưng khi lắc đều lại trở nên đồng nhất là được. Vắc xin phải giữ được độ ổn định sau 2 năm ở điều kiện bảo quản 2 - 80C và khoảng 1 tháng ở nhiệt độ phòng.
3.5.10.3. Phương pháp kiểm tra vô hoạt vắc xin
- Tiêm ít nhất 100 trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi, mỗi trứng 0,2 ml vắc xin vào xoang niệu mô. Ấp các trứng đã được tiêm ở tủ ấm 370C trong 5 ngày. Mổ thu hoạch nước trứng làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và kiểm tra bệnh tích phôi (IB).
- Vắc xin được coi là vô hoạt khi phôi không có bệnh tích đặc trưng của virus IB và nước trứng cho kết quả âm tính trong phản ứng ngưng kết hồng cầu với kháng nguyên virus Newcastle.
3.5.10.4. Phương pháp kiểm tra an toàn
- Sử dụng ít nhất 10 gà 21-28 ngày tuổi từ đàn gà sạch bệnh, chưa sử dụng vắc xin Newcastle và vắc xin IB. Mỗi gà được sử dụng 2 liều vắc xin theo đường tiêm bắp. Quan sát gà trong 21 ngày.
- Nếu trong quá trình quan sát, nhiều hơn 2 gà bị chết với nguyên nhân không phải đặc trưng của bệnh Newcastle và bệnh IB, thì tiến hành kiểm tra nhắc lại.
- Vắc xin được coi là an toàn nếu tất cả gà sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân.
3.5.10.5. Phương pháp kiểm tra hiệu lực
- Sử dụng 40 gà 21-28 ngày tuổi từ đàn gà sạch bệnh chia làm 2 nhóm:
+ Nhóm 1: gồm 20 con, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo đường tiêm bắp;
+ Nhóm 2: gồm 10 con làm đối chứng, không tiêm vắc xin.
- Sau khi tiêm 21 ngày, tất cả gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, thu huyết thanh làm phản ứng HI để kiểm tra kháng thể Newcastle, thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra kháng thể kháng virus IB.
- Vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu:
Hiệu giá HI (Newcastle) đạt 4log2 (1:16) trở lên, có ít nhất 80% mẫu dương tính với Elisa -IB đối với gà nhóm 1 (gà miễn dịch) và có ít nhất 80% mẫu âm tính với Elisa - IB, hiệu giá HI (Newcastle) ≤ 2log2 (1:4) đối với gà nhóm 2 (gà đối chứng).