3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Loài mọt đậu đỏ C. maculatus Fabricius
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Đậu đen (Vigna cylindrica), đậu xanh (Vigna radiata), đậu đỏ (Vigna angularis), đậu trắng (Vigna unguiculata).
3.1.3. Dụng cụ nghiên cứu
Các dụng cụ phục vụ cho nghiên cứu thu thập quần thể côn trùng, nhân nuôi trong phòng thí nghiệm gồm:
- Dụng cụ thu bắt, phân loại côn trùng hại kho: Rây sàng côn trùng, xiên, lọ đựng mẫu, khay, bút lông, đèn pin, hộp đựng, panh, ống nghiệm, túi PE, ...
- Kính lúp: loại cầm tay phóng đại 10X, kính soi nổi Leica, kính hiển vi Leica DM 2500, đĩa petri, tủ định ôn, máy đo độ ẩm, tủ sấy thức ăn nuôi côn trùng, giá để mẫu, sổ ghi chép, …
- Hóa chất thí nghiệm: cồn 700, formol 5%, lọ độc và các hóa chất khác.
3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng kỹ thuật trạm kiểm dịch thực vật Chi Ma, tỉnh Lạng Sơn. - Phòng kỹ thuật chi cục kiểm dịch thực vật vùng VII, tỉnh Lạng Sơn
3.2.2. Thời gian
- Từ tháng 3/2019 đến tháng 2/2020.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra thành phần, mức độ xuất hiện của sâu mọt hại hạt đậu đỗ nhập khẩu tại cửa khẩu Chi Ma, Lạng Sơn.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh vật học, sinh thái học của mọt đậu đỏ C. maculatus.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Điều tra thành phần sâu mọt hại đậu đỗ nhập khẩu tại cửa khẩu Chi Ma, Lạng Sơn Ma, Lạng Sơn
Mẫu được lấy theo tiêu chuẩn Việt Nam QCVN 01 - 141: 2013/BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2013) về phương pháp lấy mẫu kiểm dịch thực vật. Điều tra các lô hàng được nhập về lấy mẫu lưu kho qua cửa khẩu ở Lạng Sơn theo từng tháng (2 - 4 lần/tháng) ghi chép nguồn gốc xuất xứ của lô hàng ở các vùng khác nhau của Trung Quốc. Các điểm lấy mẫu được quy định theo nguyên tắc 5 điểm chéo góc. Lưu mẫu qua từng đợt điều tra và mẫu được kiểm tra sau các thời gian 1, 3, 6 tháng theo dõi sự xuất hiện các loài mọt trên các nguyên liệu đậu đỏ khô. Chỉ tiêu theo dõi: độ thường gặp (%); mật độ mọt (con/kg).
3.4.2. Phuơng pháp xử lý vào bảo quản mẫu
- Xử lý mẫu: Đối với côn trùng trưởng thành: Sau khi xử lý bằng lọ độc KCN, sấy ở nhiệt độ thấp rồi tăng dần nhiệt độ lên để làm khô mẫu (Sấy ở nhiệt độ 30oC đến 40oC trong 2 ngày rồi tăng dần lên 50oC - 60oC trong 7 đến 10 ngày tùy theo kích thước của sâu mọt). Đối với sâu non: để sâu non nhịn đói 1 ngày cho bài tiết sạch bụng sau đó cho vào ống nghiệm luộc bằng nước lã trên đèn cồn không để sôi, khi sâu non duỗi thẳng là đạt yêu cầu.
- Bảo quản mẫu sâu mọt: Lưu giữ sâu mọt ướt: Ngay sau khi thu thập được mẫu sâu mọt trong các lần điều tra, mẫu được lựa chọn và cho vào lọ thuỷ tinh có nắp đậy chứa cồn 700C. Lưu giữ mẫu sâu mọt khô: tủ định ôn, các khay dùng để sấy sâu mọt, các lọ đựng. sau khi sấy, để nguội cho vào lọ nút mài bảo quản nơi khô mát, ghi nhãn gồm: Ký hiệu mẫu, nơi thu thập, vật bị hại, ngày thu mẫu,...
* Phương pháp định loại mẫu côn trùng dựa vào: Tài liệu định loại côn trùng trong kho của: Bùi Công Hiển (1995), Vũ Quốc Trung (1981).
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Tên loài côn trùng gây hại (tên Việt Nam và tên khoa học). - Tính tỉ lệ thành phần loài, độ thường gặp (Mức độ phổ biến)
Tỉ lệ thành phần loài (%) = 100
- Độ thường gặp để đánh giá mức độ phổ biến của từng loài côn trùng theo không gian điều tra
Độ thường gặp (%) = Số điểm điều tra có chứa loài a x 100 Tổng số điểm điều tra
Trong đó: - : Mức độ phổ biến rất ít (Độ thường gặp < 25%) +: Mức độ phổ biến ít (Độ thường gặp >25-50%) ++: Mức độ phổ biến nhiều (Độ thường gặp >50-75%) +++: Mức độ phổ biến rất nhiều (Độ thường gặp > 75%)
3.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của loài mọt đậu đỏ C. maculatus maculatus
3.4.3.1. Phương pháp nhân nuôi nguồn mọt đậu đỏ
Mọt đậu đỏ thu thập được từ nguồn hàng nhập khẩu vào Việt Nam. Các hạt đậu đỏ để trong tủ lạnh từ 0-4oC trong vòng 3 tuần để loại bỏ các loài sâu mọt khác, Cho các hạt đậu đỏ sạch vào 3 lọ nhựa 2 lít nắp được phủ lớpvải màn cho vào đấy khoảng 1 kg đậu cùng với 100 trưởng thành mọt đậu đỏ. Nguồn thức ăn thường xuyên được bổ sung đồng thời tách bỏ những con trưởng thành và thu trứng từng ngày để theo dõi.
3.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh vật học, sinh thái học của loài mọt đậu đỏ C. maculatus
* Nghiên cứu đặc điểm hình thái:
Các pha của mọt đậu đỏ C. maculatus mới vũ hóa (chuyển pha) 24h được thu riêng. Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái, đo đếm kích thước từng pha của mọt nghiên cứu, đơn vị đo mm ( n=30).
+ Pha trứng : đo chiều dài và chiều rộng. + Pha sâu non: đo chiều dài và độ rộng đầu.
+ Pha nhộng và pha trưởng thành: đo chiều dài và phần rộng nhất của cơ thể.
+ Kích thước trung bình tính theo công thức: ∑Xi
X = N
Trong đó: Xi: Giá trị kích thước cá thể thứ i N: Số cá thể theo dõi.
+ Tính sai số theo công thức:
X = X ± Trong đó:
t: tra bảng Student – Fisher với độ tin cậy P = 0,95 và độ tự do v = n – 1 n: số cả thể theo dõi; σ: Độ lệch chuẩn.
* Nghiên cứu thời gian phát dục các pha, vòng đời của mọt C. maculatus
- Đưa khoảng 200 gram đậu đỏ đã xử lý vào hộp nhựa kích thước đường kính 9 cm x chiều cao 12 cm. Thả 10 cặp trưởng thành mọt đậu đỏ mới vũ hóa 1- 3 ngày vào, sau 1 ngày dùng sàng tách trưởng thành mọt đậu đỏ ra khỏi hộp và thu được số lượng lớn trứng để đủ cho theo dõi các pha phát dục.
Bố trí thí nghiệm theo phương pháp nuôi cá thể Sonali & cs. (2018)-
- Pha trứng: kiểm tra hàng ngày cho đến khi trứng nở thành sâu non. Theo dõi sự phát dục của trứng trên các đĩa petri qua kính lúp điện (n= 60)
- Pha sâu non: hàng ngày theo dõi thời gian sâu non đục vào trong hạt bằng cách quan sát các hạt tinh bột hạt thải lại vào các vỏ trứng rỗng, theo dõi thời gian phát dục của sâu non các tuổi bằng cách mỗi ngày lấy 10 hạt đậu ngâm nước từ 1-2 giờ cho mềm ra. Tách hạt lấy sâu non để đo đếm và quan sát các pha sâu non, nhộng phát triển bên trong hạt. Tiến hành tách hạt hàng ngày cho đến khi trưởng thành ở phần hạt còn lại vũ hóa (n=30), đơn vị đo mm.
- Pha nhộng: tiếp tục theo dõi và đếm số lượng mỗi ngày một lần. Ghi chép thời điểm khi sâu non tuổi cuối bắt đầu hóa nhộng và khi nhộng vũ hóa trưởng thành.
- Pha trưởng thành: Chọn trưởng thành đực - cái mới vũ hóa ghép đôi và nuôi trong hộp nhựa nhỏ hình chữ nhật có chiều dài 10cm, chiều rộng 5cm, chiều cao 5cm bên trong có thức ăn là hạt đậu đã xử lý. Theo dõi mỗi ngày một lần quan sát tìm thấy quả trứng đẻ đầu tiên và ghi chép ngày đẻ trứng.
- Vòng đời của mọt được tính từ khi trứng nở đến khi mọt trưởng thành đẻ quả trứng đầu tiên. Thí nghiệm thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng. Số cá thể theo dõi từng pha, n>30
∑Xi.ni
+ Thời gian phát dục trung bình của cá thể: X =
N Trong đó:X: Thời gian phát dục trung bình Xi: Thời gian phát dục của cá thể thứ i ni: Số cá thể lột xác trong ngày thứ i
* Nghiên cứu sức sinh sản của mọt đậu đỏ
Thí nghiệm thực hiện theo phương pháp Sonali & cs. (2018)- mọt đậu đỏ được nuôi trong môi trường thức ăn là đậu đỏ, bố trí 01 cặp đực cái 1 ngày tuổi vào mỗi hộp petri đường kính 5cm có chứa (50 hạt đậu đỏ). Hàng ngày thay đậu đỏ mới và những hạt đậu đã được tiếp xúc trưởng thành mọt được quan sát đếm số trứng đẻ ra thí nghiệm theo dõi cho đến khi trưởng thành chết sinh lý.
Theo dõi các chỉ tiêu sau: Sức trứng đẻ trung bình của một cá thể cái, Số trứng đẻ trung bình trong một ngày của một con cái. Số cặp theo dõi n=20, nhiệt ẩm độ phòng thí nghiệm, thời gian chiếu sáng 16h sáng x8h tối.
* Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau đến đặc điểm sinh học của mọt đậu đỏ C. maculatus
Thí nghiệm bố trí với với 3 công thức ứng với 3 mức nhiệt độ 25oC, 300C và nhiệt độ phòng. Ẩm độ dao động từ 70- 75%. Đậu đỏ sạch được xử lý cho tiếp xúc thả trưởng thành mới vũ hoá (05 cặp) vào các hộp kích thước hộp nhựa đường kính 9cm X chiều cao 12cm bên trong đựng đậu đỏ. Mỗi hộp 100gr hạt đậu đỏ. Các hạt được kiểm tra sao cho trên mỗi hạt có 1 quả trứng và các trứng sau đó được chuyển vào hộp nhựa nhỏ đưa vào tủ định ôn nuôi ở 25oC, 300C và nhiệt độ trong phòng trung bình 27,8oC. Chỉ tiêu theo dõi: thời gian phát triển từ trứng đến trưởng thành vũ hóa, đếm số trưởng thành vũ hóa, cân trọng lượng của trưởng thành (10 con).
Ghép trưởng thành mới vũ hóa ở các mức nhiệt độ khác nhau tiếp tục ghép đôi theo dõi thời gian sống, sức sinh sản. Chỉ tiêu theo dõi: Số trứng đẻ của một con cái, thời gian sống.
*Xác định thời gian đẻ trứng trong ngày của trưởngthành mọt C. maculatus
- Cho một cặp trưởng thành mọt đậu đỏ vào hộp chứa thức ăn khoảng 50 hạt đậu đỏ. Khoảng thời gian tiếp xúc cho trưởng thành đẻ trứng được phân chia
các khoảng là 6-8h, 8-10h, 10-12h, 12-14h, 14-16h, 16-18h và 18-6h. Quan sát trực tiếp sau mỗi khoảng thời gian tiếp xúc, đếm số trứng được đẻ ra. Thí nghiệm theo dõi 10 cặp trưởng thành trong 3 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: Số trứng trưởng thành đẻ trong các khoảng thời gian theo dõi.
Sức sinh sản (quả/cái) =
Tỉ lệ trứng nở (%) = 100
Tỉ lệ đực/cái =
Thời gian đẻ trứng TB (ngày/con) =
Số trứng đẻ trung bình trong ngày của con cái (Số trứng (ST)/ngày):
ST/ngày =
* Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thức ăn khác nhau đến thời gian phát dục, số lượng mọt đậu đỏ
Thí nghiệm theo phương pháp của Badoor & cs. (2009). Các loại đậu được xử lý. Thí nghiệm bố trí với 5 công thức. Thả trưởng thành mới vũ hoá (05 cặp) vào các hộp kích thước hộp nhựa đường kính 9cm x chiều cao 12cm bên trong đựng các loại thức ăn khác nhau. Mỗi hộp 100gr hạt đậu nguyên hạt các loại.
Thí nghiệm với 04 công thức:
Công thức 1: Đậu xanh; Công thức 2: Đậu trắng Công thức 3: Đậu đỏ; Công thức 4: Đậu đen
Chỉ tiêu theo dõi: thời gian phát triển từ trứng đến trưởng thành vũ hóa, đếm số trưởng thành vũ hóa, cân trọng lượng của trưởng thành (10 con). Số trưởng thành vũ hóa thường sau 25- 30 ngày được tính bởi số con cái được sinh ra từ 1 con mẹ của thế hệ trước trên mỗi loại đậu.
Hình 3.1. Nuôi mọt đậu đỏ trên các loại thức ăn khác nhau
Hình 3.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của mật độ mọt đến tỷ lệ
hao hụt thức ăn
* Nghiên cứu sự ưa thích đẻ trứng của mọt đậu đỏ
Theo phương pháp của Islam & cs. (2007). Thí nghiệm với 4 loại đậu (đậu đỏ, đậu xanh, đậu đen, đậu trắng..).
- Thí nghiệm không có sự lựa chọn: 50 hạt đậu mỗi loại để riêng vào hộp nhựa nhỏ các hạt không chồng lên nhau. Cho 1 cặp trưởng thành vũ hóa 3 ngày tuổi đưa vào hộp để dẻ trứng, sau 48h chuyển trưởng thành ra khỏi hộp.
- Thí nghiệm có sự lựa chọn: cho 50 hạt đậu của mỗi loại đồng thời cho vào hộp đĩa petri 10 cm hoặc hộp nhựa lớn hơn chuyển 1 cặp trưởng thành vũ hóa 3 ngày tuổi đưa vào hộp để dẻ trứng, sau 48h chuyển trưởng thành ra khỏi hộp.
Chỉ tiêu theo dõi Số trứng đẻ, tỷ lệ trứng nở, thời gian phát triển từ trứng- trưởng thành, tỷ lệ trưởng thành vũ hóa trên mỗi công thức loại đậu. Thí nghiệm nhắc lại 3 lần/công thức.
* Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ sâu non mọt đậu đỏ đến hao hụt trọng lượng và tỷ lệ nảy mầm của các loại đậu.
Cho 1 cặp trưởng thành vào hộp nhựa nhỏ bên trong có 5-10 hạt đậu đã được cân trước và đánh dấu riêng cho tiếp xúc trong 24- 48h sau đấy đưa trưởng thành ra khỏi hộp lọai bỏ các trứng để sao cho mỗi hạt đậu có từ 1- 4 quả trứng tương ứng với các mật độ sâu non là 1,2, 3 và 4 con/hạt đậu và đối chứng đậu sạch không có mọt. Khi trưởng thành vũ hóa loại trưởng thành ra từ các mật độ sâu non thì cân lại trọng lượng hạt. Mỗi công thức mật độ nhắc lại n= 30 . Chỉ tiêu theo dõi thời gian phát triển từ trứng- trưởng thành, tỷ lệ trưởng thành vũ hóa trên mỗi công thức.
Xác định tỷ lệ nảy mầm:
Các hạt đậu từ các công thức ở các mật độ khác nhau sau khi lây nhiễm mọt 2 tuần thì được gieo vào các cốc nhỏ thể tích 640ml đường kính 6 cm bên trong cốc có đất hạt gieo sâu khoảng 2,5 cm so với bề mặt sau khoảng thời gian 1 tuần- 10 ngày sẽ thấy hạt nảy mầm nếu hạt không nảy mầm là sau 1 tháng không thấy nảy mầm từ đất. Bên cạnh đấy có thể tạo vết thương nhân tạo cho hạt đậu bằng giấy ráp chiếm khoảng 5% bề mặt hạt để so sánh tỷ lệ nảy mầm. Tính tỷ lệ hao hụt trọng lượng theo Kenton & Carl (1978).
Tỷ lệ hao hụt trọng lượng (%) x100
OW CW OW −
=
Trong đó: OW: khối lượng chất khô của mẫu ban đầu CW: khối lượng chất khô của mẫu thí nghiệm cuối cùng.
- Trọng lượng thức ăn hao hụt được tính theo công thức của Karanxing, (1980):
P = 50 – Pt – Po (gam)
Trong đó: P trọng lượng thức ăn hao hụt ở công thức thí nghiệm Pt trọng lượng thức ăn cân được sau 1 thời gian bảo quản Po trọng lượng thức ăn hao hụt ở công thức đối chứng.
Hình 3.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu sự ưa thích đẻ trứng trên các ký
chủ khác nhau
Hình 3.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ hao hụt trọng lượng trên
* Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ mọt trưởng thành mọt đậu đỏ đến tỷ lệ hao hụt trọng lượng hạt đậu đỏ
Bố trí thí nghiệm: Thả trưởng thành mới vũ hóa vào các hộp nhựa đựng đậu đỏ. Mỗi hộp 200gram hạt đậu đỏ đã được xử lý. Thí nghiệm với 05 công thức:
Công thức 1: 1 cặp; Công thức 2: 5 cặp Công thức 3: 15 cặp Công thức 4: 20 cặp Công thức 5: đối chứng không có mọt
Mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Theo dõi, kiểm tra thí nghiệm sau khi thả mọt 30, 60, 90 và 120 ngày. Tại thời điểm kiếm tra, dùng rây sàng mọt ra khỏi đậu để kiểm tra mật độ mọt (pha trưởng thành; con/kg) và cân khối lượng đậu, tính mức độ hao hụt ở các công thức sau khi kiểm tra.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hao hụt (%) và đếm số lượng hạt đậu đỏ và cân trọng lượng từng nhóm mọt đậu đỏ.
Công thức tính:
Trong đó:
U: Trọng lượng hạt không bị hại; Nu : Số hạt không bị hại D : Trọng lượng hạt bị hại; Nd : Số hạt bị hại
* Nghiên cứu sức sinh sản của mọt C. maculatus trên môi trường có hiện diên trưởng thành đực và không có cá thể đực.
Mọt trưởng thành mới vũ hóa được tách riêng rẽ trong từng hộp nhựa có chứa 50 hạt đậu đỏ. Bố trí thí nghiệm theo 2 công thức, nhắc lại 30 lần/1 công thức:
CT 1. Có sự hiện diện của trưởng thành đực trong suốt thời gian theo dõi CT 2. Không có sự hiện diện của trưởng thành đực