Được thực hiện tại Viện nghiên cứu phát triển dược và mỹ phẩm.
Vật liệu phân tích: Là các mẫu cây Lan gấm (A.formosanus) tươi (thân, rễ, lá) từ cây tự nhiên, cây nuôi trồng trong nhà lưới và trồng dưới tán rừng.
2.3.7.1. Máy móc, thiết bị sử dụng
Trong quá trình nghiên cứu, đề tài sử dụng các thiết bị, dụng cụ được quản lý theo hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 (bao gồm: Máy quang phổ UV-VIS, Máy AAS Shimadzu, Máy HPTLC, Máy siêu âm, Cân điện tử, cân kỹ thuật Prescia, Tủ sấy Memmert, Tủ lạnh, Ống đong các loại (10- 2000ml), Bình cầu đáy tròn các loại 50-2000ml, Bình chạy sắc ký 10 x 20 cm, Bình chiết, phễu, cốc, buret…)
2.3.7.2. Dung môi, hoá chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.3
B...2.3 Hoá chấ , d mô sử dụ o h cứ
Nguyên vật liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Chất chuẩn Quercetin Sigma - Aldrich TCNSX
Chất chuẩn Kaempferol Sigma - Aldrich TCNSX
Chất chuẩn Rutin Sigma - Aldrich TCNSX
Chất chuẩn Clitozin Sigma - Aldrich TCNSX
Methanol Merck-Đức HPLC
Acid ortho phosphoric Merck-Đức HPLC
Ethylacetat Trung Quốc PA
Acid sulfuric Trung Quốc PA
Acid formic Trung Quốc PA
Acid acetic Trung Quốc PA
Acid chlohydric Trung Quốc PA
Methanol Trung Quốc PA
2.3.7.3. Phương pháp thực hiện
a) Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Thử theo Dược điển Việt Nam V, Phụ lục 5.4 [9] Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Dung dịch thử: Cân khoảng 1 g Lan gấm (A.formosanus), thêm 10ml MeOH, siêu âm 30 phút, lọc, thu được dung dịch chấm sắc ký.
Dung dịch chất đối chiếu: Dung dịch chất đối chiếu với nồng độ 1mg/ml gồm rutin, clitozin, quercetin và isorhamnetin-3-O-glycopyranoside.
Thuốc thử H2SO4: Cho từ từ 6 ml acid sulfuric (TT) vào 50 ml ethanol 96o, lắc liên tục. Làm nguội, thêm ethanol 96o vừa đủ 100 ml.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 5 l mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng để khô ở trong không khí. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng để khô ở trong không khí. Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, đốt bản mỏng ở 105oC trong 5 phút. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 và 366 nm.
b) Định lượng tổng flavonoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis
Nguyên tắc: Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chan và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu.
Chuẩn bị mẫu thử: Dung môi chiết Ethanol, phương pháp chiết nóng thu được phương pháp chuẩn bị mẫu như sau: Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình cầu, chiết ở 60oC bằng Ethanol 80% tỷ lệ dược liệu / dung môi = 1:10, thời gian chiết là 1h/ lần. Lọc dịch chiết, gộp dịch chiết 3 lần, định mức bằng Ethanol 80% đến 100ml, đem cô quay chân không thu được cao dược liệu. Cao được sấy khô, hoà tan trong EtOH 80% và tiến hành phản ứng định lượng.
Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 5mg quercetin và đem pha loãng với Ethanol thu được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 1mg/ml. Pha dãy dung dịch chuẩn với nồng độ 0,03125 – 0,5 mg/ml. Ứng với mỗi nồng độ dung dịch pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống nghiệm sau đó cho vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1ml AlCl310%; 0,1 ml CH3COOK 1M; và 2,8 ml nước cất. Lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo màu ở 415 nm, mẫu trắng thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất.
Đo riêng biệt các dung dịch chuẩn, ghi nhận giá trị Abs của chất chuẩn. Thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính mô tả sự phụ thuộc giữa nồng độ dung dịch chất chuẩn (mg/ml) và giá trị Abs tương ứng theo phương trình y = ax + b.
Đo và ghi nhận giá trị Abs của dung dịch thử. Tính nồng độ C (mg/ml) của chất chuẩn trong dung dịch thử dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính đã xây dựng.
Hàm lượng (%) chất chuẩn trong mẫu thử (tính theo dược liệu khô kiệt) được tính theo công thức sau:
F (%) = x N x H
Trong đó:
C : Nồng độ chất chuẩn trong mẫu thử (mg/ml) tính từ phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng.
V : Thể tích dịch chiết (ml)
m : Khối lượng cao chiết có trong thể tích (g) N : Độ ẩm cao chiết
H : Hiệu suất chiết cao