B...3.3: Đặc đ ểm hậ b ế nhanh mộ số o h ộc ch La k m ế
(Anoectochilus Blume) ở Tha h Hóa
TT Tên loài Đặc đ ểm hậ b ế nhanh
1
Kim tuyến Trung bộ (Anoectochilus annamensis Aver)
- Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên, mặt dưới mầu nhạt hơn; phủ lông mịn như nhung; hệ gân mạng lưới lông chim nổi rõ, thường có 5 gân gốc
2
Kim tuyến đá vôi (Anoectochilus calcareus Aver)
- Đặc điểm dễ nhận dạng nhất là hình thái của lá: Lá hình trứng phiến lá dầy, có lông mượt như nhung; lá có nhiều màu (từ màu xanh thẩm đậm, mầu xanh phớt tím, mầu xanh nâu sẫm hoặc nâu nhạt). Lá cây trưởng thành có kích thước lớn nhất trong các loài thuộc chi Anoectochilus
Blume
3
Giải thùy Elwes (Anoectochilus elwesii
(C.B.Clarke ex Hook.f.) King & Pantl)
- Lá màu nâu tím, mặt trên đậm hơn mặt dưới, lá nhẵn không có lông; cánh hoa có bớt đỏ hay nâu.
- Hoa: môi trắng cọng bìa có 6 tua mỗi bên, bìa có 2 sọc đỏ
4
Lan gấm (Anoectochilus formosanus Hayata)
- Lá hình trứng mặt trên màu xanh thẫm, mặt dưới nâu đỏ; hệ gân mạng lưới lông chim màu trắng bạc, đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt; - Hoa cọng bìa môi và các tua màu vàng.
5
Kim tuyến tơ
(Anoectochilus setaceus
Blume)
- Lá từ xanh đến xanh đậm hoặc màu nâu đỏ; gân lá màu vàng hoặc màu hồng.
- Hoa: cọng bìa môi hoa có 5 – 8 tua dài mảnh, tua mầu trắng.
3.3. N h cứ đa dạ d ề o La ấm ồ e ạ ỉ h Thanh Hoá
3.3.1. Phân tích đa dạng di truyền Lan gấm bằng chỉ thị RAPD
3.3.1.1. Kết quả phân tích đa hình DNA của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus)
Nguồn gốc mẫu: Thu thập tự nguồn gen tự nhiên tại Khu bảo tồn các loài hạt trần quý hiếm Nam Động (Thanh Hoá), vị trí thu mẫu xem bảng 3.5.
B...3.4: Vị í h hập mẫ La ấm (A.formosanus)
Ngày tháng
Khu vực đ ều tra Kết qu ghi nhận và thu mẫu
Tên khu vực Tọa độ thu thập (VN2000, KKT105, Múi 30) Cây tái sinh Câ ưởng thành Tổng số cây 1/9/2020 Núi Nam Động X 487.695 Y 2.245.861 0 2 2 5/9/2020 Núi Nam Động X 487.514 Y 2.247.609 0 8 8
DNA tổng số của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đo OD; kết quả cho thấy tất cả các mẫu DNA đều có độ nguyên vẹn và độ sạch cao (OD260nm/OD280nm= 1,8 - 2,0). Các mẫu DNA tổng số được pha loãng để thực hiện phản ứng RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên.
Phân tích mối quan hệ di truyền của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) với 14 chỉ thị RAPD thu được 80 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, trong đó có 53 phân đoạn DNA đa hình, chiếm tỉ lệ 66,3%. Kết quả phản ứng RAPD cho thấy tất cả các mồi sử dụng đều đa hình; tuy nhiên, mức độ đa hình của các mồi rất khác nhau, dao động từ 28,6 - 85,7%, trong đó mồi RA46 có mức độ đa hình cao nhất với 6/7 phân đoạn DNA đa hình, chiếm tỉ lệ 85,7%; mồi có tỉ lệ đa hình thấp nhất là mồi CP03 (28,6%). Hầu hết các mồi có mức độ đa hình, các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên ≥ 50%. Có thể thấy rằng, các mồi sử dụng có khả năng phản ánh mức độ đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu. Khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình thể hiện ở giá trị PIC (Polymorphism information content), cho thấy giá trị PIC dao động giữa các mồi từ 0,08 đến 0,45 và đạt trung bình giữa các mồi là 0,27 phản
ánh phù hợp với mức độ đa hình của các mồi. Giá trị PIC thấp nhất 0,08 (mồi CP03) và cao nhất là 0,45 (mồi RA46). Kết quả này khẳng định tính đa hình của các mồi sử dụng và mức độ đa dạng di truyền giữa các mẫu Lan gấm nghiên cứu.
B 3.5: Kế q phâ ích đa hì h mồ RAPD o h cứ vớ 10 mẫ La ấm (A.formosanus) STT T mồ G á ị PIC Tổ số phâ đoạ DNA Số phâ đoạ DNA đa hình Tỉ ệ % số phâ đoạ DNA đa hình 1 CP03 0,08 7 2 28,6 2 CP04 0,19 6 5 83,3 3 CP06 0,13 7 4 57,1 4 CP08 0,22 5 4 80,0 5 CP09 0,15 5 2 40,0 6 CP10 0,25 4 2 50,0 7 CP11 0,22 8 5 62,5 8 CP13 0,44 4 3 75,0 9 CP15 0,42 3 2 66,7 10 OPB10 0,35 5 4 80,0 11 OPB18 0,44 3 2 66,7 12 OPD11 0,30 10 8 80,0 13 RA46 0,45 7 6 85,7 14 RA142 0,21 6 4 66,7 Tổng trung bình 0,27 80 53 66,3
3.3.1.2. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu
Từ kết quả điện di, phân tích sự biến động di truyền của các mẫu Lan gấm
(A.formosanus) nghiên cứu phụ thuộc vào sự giống nhau hay khác nhau về số phân đoạn DNA và kích thước của các phân đoạn DNA thu được từ phản ứng RAPD với
14 mồi ngẫu nhiên. Việc phân tích các phân đoạn DNA thu được dựa trên sự có mặt hay vắng mặt ở các mẫu nghiên cứu. Số liệu sau khi mã hóa 0 (phân đoạn DNA không xuất hiện) và 1 (phân đoạn DNA xuất hiện) được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc v2.1. Ma trận hệ số tương đồng và cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa theo hệ số tương đồng di truyền Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA, kết quả hệ số tương đồng di truyền được trình bày tại bảng 3.7.
B 3.6: Hệ số ươ đồ d ề kh so sá h heo cặp của 10 mẫ La ấm (A.formosanus) KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 KT7 KT8 KT9 KT10 KT1 1 KT2 0.654 1.000 KT3 0.765 0.765 1.000 KT4 0.802 0.753 0.790 1.000 KT5 0.691 0.716 0.802 0.691 1.000 KT6 0.790 0.765 0.802 0.864 0.704 1.000 KT7 0.765 0.765 0.753 0.864 0.654 0.827 1.000 KT8 0.716 0.741 0.802 0.765 0.704 0.827 0.753 1.000 KT9 0.654 0.753 0.840 0.704 0.864 0.741 0.667 0.691 1.000 KT10 0.753 0.753 0.815 0.901 0.691 0.914 0.840 0.790 0.753 1
Kết quả thu được cho thấy rằng, hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus) nằm trong khoảng từ 0,654 (khi so sách giữa mẫu KT1 và KT2, mẫu KT1 và KT9, mẫu KT5 và KT7) đến 0,914 (khi so sách giữa mẫu KT6 và mẫu KT10). Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 mẫu càng lớn thì mức độ đa dạng di truyền càng nhỏ và ngược lại, 2 mẫu có hệ số tương đồng càng thấp thì mối quan hệ di truyền giữa chúng càng xa nhau. Hay nói cách khác mức độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng 0,086 (1 - 0,914) đến 0,346 (1 - 0,654), tương ứng từ 8,6% đến 34,6%.
Hình 3.13 Sơ đồ hì h câ hể h ệ mố q a hệ d ề của 10 mẫ La ấm (A.formosanus)
Từ giá trị so sánh hệ số tương đồng di truyền, phần mềm NTSYSpc v2.1 tự động sắp xếp sơ đồ hình cây tính theo hệ số Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền giữa mẫu Lan gấm (A.formosanus). Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các mẫu. Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao sẽ được xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên hệ với nhau (hình 3.13). Kết quả cho thấy, 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu được chia thành 2 nhóm chính (kí hiệu Nhóm 1 và Nhóm 2) với mức độ tương đồng di truyền là 0,73 (tương ứng 73%). Nhóm 1 gồm có 6 mẫu (KT1, KT4, KT6, KT7, KT8 và KT10), trong đó mẫu KT6 và KT10 có độ tương đồng di truyền là 0,914 (tương ứng 91,4%). Nhóm 2 gồm 4 mẫu còn (mẫu KT2, KT3, KT5 và KT9), trong đó mẫu KT5 và KT9 có độ tương đồng d truyền là 86,4%.
Như vậy, dựa vào kết quả phân tích mối tương quan di truyền bằng 14 chỉ thị RAPD cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus)
(A.formosanus) nằm trong khoảng từ 0,086 - 0,346, tương ứng từ 8,6% đến 34,6%. Sự khác biệt di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus) thu thập tại Khu bảo tồn các loài hạt trần quý hiếm Nam Động, tỉnh Thanh Hóa cho thấy nguồn gen này cần được bảo tồn hữu hiệu để phục vụ tốt cho công tác chọn tạo và nhân giống trong tương lai.
Theo báo cáo của Nguyễn Thị Thơ và cs (2014)[39] đánh giá tính đa dạng di truyền loài loài Kim tuyến đá vôi (A.calcareus). tại Quản Bạ, Hà Giang bằng chỉ thị RAPD cho thấy mức độ sai khác di truyền giữa các mẫu nghiên cứu trong cùng một loài thấp từ 2 -25%. Ngoài việc sử dụng chỉ thị RAPD để đánh mức độ đa dạng di truyền các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), Cheng và cs (1998) [53] đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân biệt sự khác nhau giữa 2 loài: Lan gấm
(A.formosanus), loài A. koshunensis, thông qua sàng lọc 40 mồi RAPD ngẫu nhiên, đã tìm ra được 9 mồi đặc trưng cho loài Lan gấm (A.formosanus) và 10 mồi đặc trưng cho loài A. koshunensis; các chỉ thị RAPD này có thể được áp dụng cho cả việc xác định loài Lan gấm (A.formosanus), loài A. koshunensis và đánh giá mức độ lai tạo giữa 2 loài này. Ngoài sử dụng chỉ thị RAPD, Lin và cs (2007)[74] sử dụng chỉ thị ISSR và AFLP trong nghiên cứu mức độ biến đổi di truyền của 20 dòng tái sinh từ cùng một cá thể mẹ thuộc loài Lan gấm (A.formosanus), cho thấy sự biến đổi di truyền giữa các dòng nằm trong khoảng 0 - 5,43%. Zhang và cs (2010)[96] khảo sát tính ổn định di truyền các cây con vi nhân giống của loài Lan gấm
(A.formosanus) bằng kĩ thuật ISSR, cho thấy mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu là trên 94%, tỉ lệ đa hình là 2,76% trong tổng số 1810 phân đoạn DNA được nhân bản với 17 chỉ thị ISSR. Các kết quả nghiên cứu thu được đã cung cấp thêm thông tin khoa học về mức độ đa dạng di truyền của loài Lan gấm
(A.formosanus) góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này hiệu quả.
3.3.2. Phân tích một số trình tự DNA mã vạch của loài Lan gấm
Việc phân loại và định danh loài bằng phương pháp truyền thống thường dựa trên các đặc tính hình thái, đặc biệt là hoa. Tuy nhiên, các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) rất đa dạng và phong phú đồng thời các loài gần nhau
thường có hình thái tương tự nhau nên rất khó phân biệt khi thiếu hoa. Hiện nay, để định danh chính xác các loài, bên cạnh việc sử dụng các đặc điểm hình thái thì việc sử dụng các chỉ thị phân tử là rất cần thiết. Trong các loại chỉ thị phân tử thì chỉ thị DNA mã vạch đang được sử dụng phổ biến nhất để phân loại và định danh loài (Group et al., 2009)[57]. Hebert (2003) [60] đã đề xuất DNA mã vạch như là một phương pháp để định danh loài. Định danh loài dựa vào các đoạn DNA mã vạch đặc trưng đảm bảo độ chính xác cao; đặc biệt hữu dụng và khắc phục được hạn chế của phương pháp phân loại chỉ dựa vào hình thái. Việc nghiên cứu nhận dạng và định danh một số loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) ở Việt Nam bằng chỉ thị DNA mã vạch cũng đã được báo cáo (Huỳnh Hữu Đức và cộng sự, 2019[14]. Trong nội dung nghiên cứu này, ba đoạn trình tự DNA mã vạch đặc trưng là matK, rbcL ITS2 của loài Lan gấm (A.formosanus) thu thập tại Thanh Hóa đã phân lập, xác định và phân tích trình tự DNA làm cơ sở dữ liệu phân tử phục vụ công tác phân loại, nhận dạng và bảo tồn nguồn gen.
3.3.2.1. Kết quả nhân bản đoạn trình tự gen matK, rbcL và ITS2
Gen matK là một trong những gen mã hóa nằm trong lục lạp, có thể nhân bản một cách dễ dàng ở nhiều loài thực vật, đây là trình tự gen được sử dụng rộng rãi để định danh các loài thực vật (Vijayan và Tsou, 2010) [90]. Một số đoạn trình tự DNA mã vạch matK của các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) đã được công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế (NCBI). Trên cơ sở các công trình đã công bố, trong nghiên cứu này đã sử dụng cặp mồi, mồi xuôi 3F_KIM_f: 5’-CGT ACA GTA CTT TTG TGT TTA CGA G-3’ và môi ngược: 5’-ACC CAG TCC
ATC TGG AAA TCT TGG TTC-3’ để nhân bản đoạn gen matK từ mẫu DNA tổng số của loài Lan gấm (A.formosanus). Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen matK trên bản gel agarose 1% cho thấy đoạn gen matK đã được nhân bản đặc hiệu, băng DNA có kích thước khoảng 800 bp như tính toán lý thuyết khi so với thang DNA chuẩn 100 bp (Hình 3.14a); có thể khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen matK ở loài Lan gấm (A.formosanus).
Tương tự gen matK, gen rbcL cũng là một gen nằm trong lục lạp và có thể nhân bản một cách dễ dàng ở nhiều loài thực vật. Sử dụng cặp mồi, mồi xuôi rbcLa-
M 1 a M1 b M 1 c
F 5’- ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC-3’ và mồi ngược rbcLa-R GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG-3’ đã nhân bản thành công đoạn gen rbcL từ mẫu DNA tổng số của loài Lan gấm (A.formosanus). Băng DNA nhân bản đặc hiệu có kích thước khoảng 600 bp khi so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp (Hình 3.14b); kết quả này có thể khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen rbcL ở loài Lan gấm (A.formosanus).
Gen ITS2 là gen nằm trong nhân tế bào và cũng có thể nhân bản một cách dễ ràng ở nhiều loài động, thực vật. Đoạn gen ITS2 cũng được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong việc định danh, phân loại các loài động, thực vật (Vijayan and Tsou, 2010; Yao và cs 2010; Yong và cs 2010) [90, 97, 100]. Nhân bản đoạn gen ITS2 từ mẫu DNA tổng số của loài Lan gấm (A.formosanus) bằng phản ứng PCR với cặp mồi,
ITS2PF: 5’- ACG AAT TCA TGT CCG GTG AAG TGT TCG -3’ và mồi ngược
ITS2PR: 5’- TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTAC -3, kết quả
điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy đoạn gen ITS2 đã được nhân bản đặc hiệu, băng DNA có kích thước khoảng 350 bp như tính toán lý thuyết khi so với thang DNA chuẩn 100 bp (Hình 3.14c); có thể khẳng định đã nhân bản thành công đoạn gen ITS2 ở loài Lan gấm (A.formosanus). Các sản phẩm nhân bản đoạn gen matK,
rbcL và ITS2 được tinh sạch và giải trình tự nucleotide.
Hình 3.14: Các s phẩm hâ b đoạ e
a - Sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK; b - Sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL; c - Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS2 từ DNA tổng số của loài Lan gấm (A.formosanus) trên gel agarose 1,0%. M – thang DNA chuẩn 100 bp.
3.3.2.2. Phân tích trình tự các đoạn DNA mã vạch
a) Trình tự nucleotide đoạn gen matK
Kết quả xác định trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus), cho thấy đoạn gen được nhân bản có kích thước 790 bp.
Sau khi giải trình tự nucleotide đoạn gen matK, trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit và công cụ BLAST trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI), thu được đoạn gen matK có kích thước 790 bp với chất lượng tốt. Sử dụng đoạn trình tự gen matK để phân tích và so sánh với một số trình tự gen khác trên Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả trình tự nucleotide đoạn gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus) thu thập tại Thanh Hóa đã được đăng trên GenBank (NCBI) với mã số MW678627, như sau: AAGATGTTCCTTCTTTGCATTTGTTGCGATTTATTTTCCACGAATATCATAATTTGAAGAGTATCATTA CTTCAAATAAATCCATTCACGTTTTTTCAAAAAAAAAGAAAAGAATTTTTTGGTTCCTACATAATTTT TATGTATATGAATGCGAATATCTCTTTCTTTTTCTTCGTAAAAATTCTTCTTATTTACGATCAACATCTT TTGGAGTCTTTATTGAGCGAACACTTTTTTATGTAAAAATGGAATCTATTCTAGTAGTATATTTTAATT CTTTTCAGAGGATTCTCTGGTTCCTCAAAGATCCTTTCATACATTATGTTCGATATCAAGGAAAAGTA ATTCTGACTTCAAAGGTAACTCTTATTCTGATGAAGAAATGGAATTTTCATGTTGTGAATTTTTGTCA ATTTTATTTTCACTTTTGGTCTCAACCTTATAGGATCCATATAAAGCAATTACCCAACTATTCCTTCTC TTTTCTGGGGTATTTTTTAAGTGTACAAAAAAAAACTTTGGTAGTAAGAAATCAAATGCTAGAGAATT CCTTTCTAATAAATACTATGACTAAGAAATTAGATACCGTAGCCCCAGTTATTTCTCTTATTGGATCA TTGTCGAAAGCTCAATTTTGTACTATATCAGGTCATCCTATTAGTAAACCCATTTGGACTGATTTTTCG GATTCTGATATTATTGATCGATTTTGTCGGAAATGTAGAAATCTTTGTCGTTATCACAGCGGATCCTC AAAAAAAAAAGTTTTGTATCGTATAAAATATATATT
Trình tự nucleotide của đoạn gen matK thu được này được so sánh với 7 trình tự gen matK của các loại khác cùng thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) và 1 loài thuộc chi Ludisia - đây là chi có đặc điểm hình thái khá giống với các loài chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) nhờ công cụ BLAST trên NCBI. Kết quả cho thấy, trình tự gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu có mức độ tương đồng 99,87% cao nhất với trình tự gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus) có mã số trong Ngân hàng gen quốc tế là EU797513.1 và tương đồng với các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) từ 98,72 - 99,75% (tương ứng với loài A. lylei mã số JN166019.1 là 98,72%; loài A. elatus mã số KU687098.1 là 98,95%; loài A. albolineatus mã số JN166018.1 là 98,98%; loài
số EU797512.1 là 99,62% và loài A. roxburghii mã số KY966708.1 là 99,75%) và loài Ludisia discolor mã số AJ543947.1 là 96,83%. Trên cơ sở mức độ tương đồng về trình tự nucleotide gen matK của loài Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu với 7 trình tự nucleotide gen matK của các loài khai thác trên dữ liệu Ngân hàng gen NCBI, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA7 (Hình 3.15); kết quả cho thấy, loài Lan gấm (A.formosanus) thu thập tại Thanh Hóa và