3.3.1.1. Kết quả phân tích đa hình DNA của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus)
Nguồn gốc mẫu: Thu thập tự nguồn gen tự nhiên tại Khu bảo tồn các loài hạt trần quý hiếm Nam Động (Thanh Hoá), vị trí thu mẫu xem bảng 3.5.
B...3.4: Vị í h hập mẫ La ấm (A.formosanus)
Ngày tháng
Khu vực đ ều tra Kết qu ghi nhận và thu mẫu
Tên khu vực Tọa độ thu thập (VN2000, KKT105, Múi 30) Cây tái sinh Câ ưởng thành Tổng số cây 1/9/2020 Núi Nam Động X 487.695 Y 2.245.861 0 2 2 5/9/2020 Núi Nam Động X 487.514 Y 2.247.609 0 8 8
DNA tổng số của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đo OD; kết quả cho thấy tất cả các mẫu DNA đều có độ nguyên vẹn và độ sạch cao (OD260nm/OD280nm= 1,8 - 2,0). Các mẫu DNA tổng số được pha loãng để thực hiện phản ứng RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên.
Phân tích mối quan hệ di truyền của 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) với 14 chỉ thị RAPD thu được 80 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, trong đó có 53 phân đoạn DNA đa hình, chiếm tỉ lệ 66,3%. Kết quả phản ứng RAPD cho thấy tất cả các mồi sử dụng đều đa hình; tuy nhiên, mức độ đa hình của các mồi rất khác nhau, dao động từ 28,6 - 85,7%, trong đó mồi RA46 có mức độ đa hình cao nhất với 6/7 phân đoạn DNA đa hình, chiếm tỉ lệ 85,7%; mồi có tỉ lệ đa hình thấp nhất là mồi CP03 (28,6%). Hầu hết các mồi có mức độ đa hình, các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên ≥ 50%. Có thể thấy rằng, các mồi sử dụng có khả năng phản ánh mức độ đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu. Khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình thể hiện ở giá trị PIC (Polymorphism information content), cho thấy giá trị PIC dao động giữa các mồi từ 0,08 đến 0,45 và đạt trung bình giữa các mồi là 0,27 phản
ánh phù hợp với mức độ đa hình của các mồi. Giá trị PIC thấp nhất 0,08 (mồi CP03) và cao nhất là 0,45 (mồi RA46). Kết quả này khẳng định tính đa hình của các mồi sử dụng và mức độ đa dạng di truyền giữa các mẫu Lan gấm nghiên cứu.
B 3.5: Kế q phâ ích đa hì h mồ RAPD o h cứ vớ 10 mẫ La ấm (A.formosanus) STT T mồ G á ị PIC Tổ số phâ đoạ DNA Số phâ đoạ DNA đa hình Tỉ ệ % số phâ đoạ DNA đa hình 1 CP03 0,08 7 2 28,6 2 CP04 0,19 6 5 83,3 3 CP06 0,13 7 4 57,1 4 CP08 0,22 5 4 80,0 5 CP09 0,15 5 2 40,0 6 CP10 0,25 4 2 50,0 7 CP11 0,22 8 5 62,5 8 CP13 0,44 4 3 75,0 9 CP15 0,42 3 2 66,7 10 OPB10 0,35 5 4 80,0 11 OPB18 0,44 3 2 66,7 12 OPD11 0,30 10 8 80,0 13 RA46 0,45 7 6 85,7 14 RA142 0,21 6 4 66,7 Tổng trung bình 0,27 80 53 66,3
3.3.1.2. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu
Từ kết quả điện di, phân tích sự biến động di truyền của các mẫu Lan gấm
(A.formosanus) nghiên cứu phụ thuộc vào sự giống nhau hay khác nhau về số phân đoạn DNA và kích thước của các phân đoạn DNA thu được từ phản ứng RAPD với
14 mồi ngẫu nhiên. Việc phân tích các phân đoạn DNA thu được dựa trên sự có mặt hay vắng mặt ở các mẫu nghiên cứu. Số liệu sau khi mã hóa 0 (phân đoạn DNA không xuất hiện) và 1 (phân đoạn DNA xuất hiện) được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc v2.1. Ma trận hệ số tương đồng và cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa theo hệ số tương đồng di truyền Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA, kết quả hệ số tương đồng di truyền được trình bày tại bảng 3.7.
B 3.6: Hệ số ươ đồ d ề kh so sá h heo cặp của 10 mẫ La ấm (A.formosanus) KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 KT7 KT8 KT9 KT10 KT1 1 KT2 0.654 1.000 KT3 0.765 0.765 1.000 KT4 0.802 0.753 0.790 1.000 KT5 0.691 0.716 0.802 0.691 1.000 KT6 0.790 0.765 0.802 0.864 0.704 1.000 KT7 0.765 0.765 0.753 0.864 0.654 0.827 1.000 KT8 0.716 0.741 0.802 0.765 0.704 0.827 0.753 1.000 KT9 0.654 0.753 0.840 0.704 0.864 0.741 0.667 0.691 1.000 KT10 0.753 0.753 0.815 0.901 0.691 0.914 0.840 0.790 0.753 1
Kết quả thu được cho thấy rằng, hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus) nằm trong khoảng từ 0,654 (khi so sách giữa mẫu KT1 và KT2, mẫu KT1 và KT9, mẫu KT5 và KT7) đến 0,914 (khi so sách giữa mẫu KT6 và mẫu KT10). Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 mẫu càng lớn thì mức độ đa dạng di truyền càng nhỏ và ngược lại, 2 mẫu có hệ số tương đồng càng thấp thì mối quan hệ di truyền giữa chúng càng xa nhau. Hay nói cách khác mức độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng 0,086 (1 - 0,914) đến 0,346 (1 - 0,654), tương ứng từ 8,6% đến 34,6%.
Hình 3.13 Sơ đồ hì h câ hể h ệ mố q a hệ d ề của 10 mẫ La ấm (A.formosanus)
Từ giá trị so sánh hệ số tương đồng di truyền, phần mềm NTSYSpc v2.1 tự động sắp xếp sơ đồ hình cây tính theo hệ số Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền giữa mẫu Lan gấm (A.formosanus). Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các mẫu. Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao sẽ được xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên hệ với nhau (hình 3.13). Kết quả cho thấy, 10 mẫu Lan gấm (A.formosanus) nghiên cứu được chia thành 2 nhóm chính (kí hiệu Nhóm 1 và Nhóm 2) với mức độ tương đồng di truyền là 0,73 (tương ứng 73%). Nhóm 1 gồm có 6 mẫu (KT1, KT4, KT6, KT7, KT8 và KT10), trong đó mẫu KT6 và KT10 có độ tương đồng di truyền là 0,914 (tương ứng 91,4%). Nhóm 2 gồm 4 mẫu còn (mẫu KT2, KT3, KT5 và KT9), trong đó mẫu KT5 và KT9 có độ tương đồng d truyền là 86,4%.
Như vậy, dựa vào kết quả phân tích mối tương quan di truyền bằng 14 chỉ thị RAPD cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus)
(A.formosanus) nằm trong khoảng từ 0,086 - 0,346, tương ứng từ 8,6% đến 34,6%. Sự khác biệt di truyền giữa các mẫu Lan gấm (A.formosanus) thu thập tại Khu bảo tồn các loài hạt trần quý hiếm Nam Động, tỉnh Thanh Hóa cho thấy nguồn gen này cần được bảo tồn hữu hiệu để phục vụ tốt cho công tác chọn tạo và nhân giống trong tương lai.
Theo báo cáo của Nguyễn Thị Thơ và cs (2014)[39] đánh giá tính đa dạng di truyền loài loài Kim tuyến đá vôi (A.calcareus). tại Quản Bạ, Hà Giang bằng chỉ thị RAPD cho thấy mức độ sai khác di truyền giữa các mẫu nghiên cứu trong cùng một loài thấp từ 2 -25%. Ngoài việc sử dụng chỉ thị RAPD để đánh mức độ đa dạng di truyền các loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), Cheng và cs (1998) [53] đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân biệt sự khác nhau giữa 2 loài: Lan gấm
(A.formosanus), loài A. koshunensis, thông qua sàng lọc 40 mồi RAPD ngẫu nhiên, đã tìm ra được 9 mồi đặc trưng cho loài Lan gấm (A.formosanus) và 10 mồi đặc trưng cho loài A. koshunensis; các chỉ thị RAPD này có thể được áp dụng cho cả việc xác định loài Lan gấm (A.formosanus), loài A. koshunensis và đánh giá mức độ lai tạo giữa 2 loài này. Ngoài sử dụng chỉ thị RAPD, Lin và cs (2007)[74] sử dụng chỉ thị ISSR và AFLP trong nghiên cứu mức độ biến đổi di truyền của 20 dòng tái sinh từ cùng một cá thể mẹ thuộc loài Lan gấm (A.formosanus), cho thấy sự biến đổi di truyền giữa các dòng nằm trong khoảng 0 - 5,43%. Zhang và cs (2010)[96] khảo sát tính ổn định di truyền các cây con vi nhân giống của loài Lan gấm
(A.formosanus) bằng kĩ thuật ISSR, cho thấy mức độ tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu là trên 94%, tỉ lệ đa hình là 2,76% trong tổng số 1810 phân đoạn DNA được nhân bản với 17 chỉ thị ISSR. Các kết quả nghiên cứu thu được đã cung cấp thêm thông tin khoa học về mức độ đa dạng di truyền của loài Lan gấm
(A.formosanus) góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này hiệu quả.