* Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nhân nhanh chồi:
Tham khảo một số kết quả nghiên cứu trước về nhân giống in vitro một số loài thuộc Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), nhận thấy môi trường khoáng có ảnh hưởng đến khả năng tạo cụm chồi của các loài. Tiến hành thử nghiệm khả năng tạo cụm chồi của loài Lan gấm (A. formosanus) trên 3 môi trường khoáng 1/2MS, MS và Knud được bổ sung 0,5 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar (Chi tiết thành phần của từng loại môi trường được tổng hợp tại phụ lục 02). Bình mẫu được nuôi ở nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C, cường độ ánh sáng 30 μEm−2 s−1, thời gian chiếu sáng 14h/ngày. Kết quả theo dõi sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.13, hình 3.18 và phụ lục 03.
B...3.12 Ả h hưở của mô ườ khoá đế hâ ha h chồ La ấm (A.formosanus)
Mô ườ g Tỷ ệ mẫ đa chồ (%) Số chồ TB/mẫ Số chồ ể vọ Ch ề cao TB chồ ể vọ (cm) 1/2MS 80,00 3,10 ± 0,19b 2,15 ± 0,08b 2,17 ± 0,07a MS 93,33 5,31 ± 0,16a 3,54 ± 0,12a 1,88 ± 0,08ab Knud* 66,67 2,33 ± 0,14c 1,31 ± 0,12c 1,54 ± 0,14b Sig. 0,036 0,0001 0,0001 0,001
Ghi chú: Các chữ cái a,b,c....trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 trong phép thử Duncan.
Qua số liệu bảng 3.13 cho thấy, mức ý nghĩa Sig 0,05 ở tất cả các chỉ tiêu đánh giá. Chứng tỏ môi trường dinh dưỡng khoáng có ảnh hưởng rõ rệt đến nhân nhanh chồi Lan gấm (A.formosanus).
Với tỷ lệ mẫu đa chồi, môi trường MS có tỷ lệ mẫu tạo đa chồi cao nhất đạt 93,33%, tiếp theo sau là môi trường 1/2MS với 80%, thấp nhất là môi trường Knud chỉ có 66,67% mẫu có khả năng nhân đa chồi.
Ngoài ra, số chồi trung bình/mẫu cũng như số chồi triển vọng (chồi có kích thước 1 cm) ở môi trường khoáng MS cũng ghi nhận những giá trị cao nhất lần lượt là 5,31 và 3,54 chồi/mẫu. Tuy nhiên, ở môi trường MS kích thước chồi trung bình chỉ đạt 1,88 cm trong khi ở môi trường 1/2MS cho kích thước trung bình 2,17 cm. Điều này có thể giải thích rằng với việc sinh sản nhiều chồi trên một mẫu cấy sẽ làm giảm khả năng phát triển chiều cao của chồi. Ở công thức môi trường Knud kết quả ghi nhận ở mức thấp nhất ở tất cả các chỉ số theo dõi so với môi trường 1/2MS và MS. Kết quả của nghiên cứu này tương đồng với kết quả đã được công bố bởi Nguyen Van Ket (2003), Phan Xuân Huyên và Nguyễn Thị Phượng Hoàng (2017) [68, 24].
Đối chiếu ở một số kết quả nghiên cứu khác với loài cùng chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume), như A. setaceus Blume có khả năng tạo cụm chồi tương đương trên ba loại môi trường 1/2 MS, MS và Knud (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2012) [34]; môi trường Knud là môi trường thích hợp nhất cho việc tạo cụm chồi và nhân nhanh chồi loài A. setaceus (Phùng Văn Phê và cs, 2010) [31].
1/2MS MS Knud
Hình 3.18 Cụm chồ La ấm (A.formosanus) mô ườ 1/2MS, MS v K d sa 8 ầ ô cấ
Như vậy, môi trường MS và 1/2MS tỏ ra vượt trội hơn và được lựa chọn để làm môi trường nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh trong các thí nghiệm tiếp theo.
* Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân chồi:
Nghiên cứu lựa chọn môi trường MS bổ sung thêm tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin kết hợp với NAA với các hàm lượng khác nhau để đánh giá khả năng nhân chồi Lan gấm (A. formosanus). Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.14, hình 3.19 và phụ lục 04.
B 3.13 Ả h hưở của các ổ hợp chấ đ ề hòa s h ưở (BAP, K e v NAA) kh ă hâ chồ La ấm (A.formosanus)
Công hức Chấ đ ề hòa s h ưở (m / ) Tỷ ệ mẫ ạo đa chồ (%) Số chồ /mẫ Ch ề cao chồ TB (cm)
BAP Kinetin NAA Số chồ TB/
mẫ Số chồ ể vọ TB/ mẫ ĐC - - - 43,33 1,47 ± 0,1e 1,29 ± 0,09d 3,05 ± 0,27a SM1 0,5 0,3 0,3 100 4,69 ± 0,17d 2,15 ± 0,07c 2,18 ± 0,09b SM2 0,5 0,3 0,1 100 5,610 ± 0,14c 3,28 ± 0,08b 2,30 ± 0,13b SM3 0,7 0,2 0,3 100 6,27 ± 0,17b 3,51 ± 0,07b 2,39 ± 0,13b SM4 0,7 0,2 0,1 100 8,75 ± 0,14a 5,04 ± 0,07a 2,35 ± 0,11b Sig. 0,0001 0,0001 0,022
Ghi chú: Các chữ cái a,b,c. trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α=0,05 trong phép thử Duncan.
Kết quả tại bảng 3.14 cho thấy: Tất cả các mẫu ở các công thức có bổ sung kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng trên đều có khả năng tạo cụm chồi (100%) và cao hơn rất nhiều so với công thức đối chứng (43,33%).
Khi phân tích số chồi trung bình và số chồi triển vọng trung bình trên mẫu cho giá trị Sig 0,05, chứng tỏ các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến số chồi Lan gấm (A. formosanus). Dẫn liệu khi kiểm tra Duncan cho thấy, công thức SM4 (MS bổ sung 0,7 mg/l BAP, 0,2 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA) có số chồi trung bình/mẫu cao nhất 8,75 chồi/mẫu; số chồi triển vọng 5,04; chất lượng chồi tốt (thân mập, lóng dài, lá to, khỏe). Đối với chiều cao trung bình mẫu, mặc dù có Sig 0,05, thể hiện sự khác nhau giữa các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng. Tuy nhiên, sự khác nhau này chưa thực sự rõ ràng, điều này được kiểm tra với tiêu chuẩn Duncan (chi tiết tại phụ lục 04). Kết quả này khá phù hợp với kết quả
của một số tác giả đi trước khi nghiên cứu một số loài cùng chi với Lan gấm (A. formosanus) như: Phùng Văn Phê và cộng sự (2010)[31] thu được kết quả môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi A.roxburghii là Knud bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l Kinetin, 0,3 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l dịch chiết khoai tây, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0,5 g/l than hoạt tính hay tương tự đối với loài A.setaseus
được Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện (2012) [34] ghi nhận môi trường thích hợp nhất cho nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,3 mg/l Kinetin, 0,3 mg/l αNAA, 20 g/l sucrose, 0,5 g/l than hoạt tính, 7 g/l agar với hệ số nhân chồi trung bình là 6,55 chồi/mẫu.
Trong thí nghiệm,thu được số chồi trung bình/mẫu và số chồi triển vọng khá cao lần lượt là 8,75 và 5,04 song trong môi trường dinh dưỡng không cần bổ sung thêm một số chất hữu cơ nước dừa, dịch chiết khoai tây như kết quả đã được báo cáo đối với loài A. roxburghii (Phùng Văn Phê và cs, 2010) [31]. Điều này là có ý nghĩa trong việc giảm giá chi phí sản xuất cây giống khi thương mại hóa cũng như công việc nhân giống được đơn giản hơn.
a b
c d
Hình 3.19 Chồ La ấm (A.formosanus) mô ườ khác ha sa 8 ầ ô cấ
Ghi chú: a- SM1, b-SM2, c-SM3, d- SM4
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, các chất điều hòa sinh trưởng thường tương tác với nhau đối với phản ứng của một mô hay cơ quan. Một số công trình nghiên cứu
trước về nuôi cấy in vitro một số loài thuộc chi Lan kim tuyến (Anoectochilus Blume) đã tìm thấy sự tổ hợp giữa cytokine và auxin cho khả năng nhân chồi tốt nhất (Phùng Văn Phê và cs, 2010; Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) [31, 34]
Kết quả nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro
Chồi in vitro đạt tiêu chuẩn (có kích thước 3 - 4 cm) được cấy chuyển sang môi trường ra rễ MS hoặc 1/2MS có 30 g/l sucrose, 0,2% than hoạt tính và bổ sung thêm NAA với các hàm lượng khác nhau. Bình mẫu được nuôi ở nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C, cường độ ánh sáng 30 μEm−2 s−1, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy thể hiện trong bảng 3.15, hình 3.20 và phụ lục 05.
B 3.14 Kh ă a ễ của chồ La ấm (A.formosanus) in vitro
Cô hức Mô ườ NAA
(mg/l) Tỷ ệ chồ a ễ (%) Số ễ TB/chồ Ch ề d ễ TB (cm) R0 MS 100 1,24 ± 0,12e 0,76 ± 0,06e R1 1/2MS 0,5 100 2,19 ± 0,08d 1,19 ± 0,04d R2 1/2MS 1,0 100 2,49 ± 0,10bcd 1,34 ± 0,07cd R3 1/2MS 1,5 100 2,61 ± 0,14bc 1,68 ± 0,07b R4 MS 0,5 100 2,33 ± 0,13cd 1,32 ± 0,07cd R5 MS 1,0 100 2,83 ± 0,08b 1,56 ± 0,10bc R6 MS 1,5 100 3,64 ± 0,08a 2,07 ± 0,12a Sig. 0,0001 0,0001
Ghi chú: Các chữ cái a,b,c. trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 trong phép thử Duncan.
Qua bảng 3.15 cho thấy: Tất cả các công thức thí nghiệm môi trường bổ sung NAA và công thức môi trường không bổ sung NAA đối chứng cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%.
Kết quả đánh giá số rễ trung bình và chiều dài rễ cho giá trị Sig 0,05, cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa các công thức thí nghiệm. Sự khác nhau này thực sự có ý nghĩa về mặt thống kê. Cụ thể, ở cả hai nhóm công thức sử dụng 1/2MS và MS, có kết quả tương tự là khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l đều cho số rễ cũng như kích thước rễ tăng lên. Cả hai nhóm công thức đều nhận được kết quả cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/l NAA. Song ở nhóm sử dụng môi trường cơ bản 1/2MS cho thấy đặc điểm của rễ kém hơn so với công thức môi trường cơ bản MS ở nồng
độ chất điều hòa sinh trưởng tương ứng. Đặc biệt đặc điểm chiều cao cây và độ mở rộng của lá ở các công thức thí nghiệm sử dụng môi trường MS đầy đủ đều tốt hơn ở các công thức môi trường 1/2MS. Điều này cho thấy, giai đoạn ra rễ hàm lượng dinh dưỡng khoáng vẫn có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của rễ cũng như sự sinh trưởng của cây. Kết quả phân tích số liệu trên cũng cho thấy khả năng sinh auxin nội sinh để kích ra rễ của Lan gấm (A. formosanus) là khá tốt nên ở công thức không bổ sung NAA các chồi Lan gấm (A. formosanus) vẫn có khả năng ra rễ. Nhưng trong quá trình theo dõi thí nghiệm cho thấy tốc độ ra rễ, chiều dài rễ và số rễ trung bình/chồi có sự khác biệt rõ rệt ở các công thức có bổ sung thêm NAA so với công thức đối chứng.
Kết quả phân tích Duncan cho thấy, công thức môi trường MS tỏ ra trội hơn so với môi trường 1/2MS về số rễ/chồi. Ở cả hai nhóm công thức môi trường 1/2MS và MS, đều thể hiện khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 đến 1,5 mg/l thì số rễ/chồi tăng lên. Mỗi nhóm công thức ra rễ, công thức bổ sung NAA 1,5 mg/l đều cho số rễ trung bình trên chồi cao nhất (R3 và R6). Công thức R6 (MS bổ sung 1,5 mg/l NAA) có số rễ cũng như chiều dài rễ vượt trội nhất (3,64 rễ/chồi và 2,07 cm/rễ). Kết quả này khá tương đồng so với kết quả của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) [34] thu được trên đối tượng A. setaseus (4,21 rễ/chồi trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l NAA).
Như vậy, môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l NAA là môi trường tỏ ra thích hợp nhất để tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường in vitro.
a b
Hình 3.20 Câ La ấm (A.fomorsanus) ho chỉ h các mô ườ khác nhau