Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.8. Phương pháp làm kháng sinh đồ
* Trang thiết bị và vật tư
Thiết bị: Tủ an toàn sinh học; Tủ ấm Memmert 350 C, 370 C; Tủ ấm CO2;
Máy đo độ đục; Máy ria kháng sinh đồ.
Dụng cụ: Đèn cồn; Que cấy; Ống thủy tinh vô trùng 5 ml; Đĩa thủy tinh sạch và kim lấy máu để phân phối khoanh giấy kháng sinh..
Hóa chất, thuốc thử: Ống nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) đã được hấp tiệt
trùng; Ống Mac Farland 0,5 và 1; - Đĩa thạch Muller
- Hinton thường có đường kính 90 mm (cho vi khuẩn dễ mọc: vi khuẩn đường ruột, Acinetobacter, Pseudomonadaceae ...) và máu (cho vi khuẩn khó mọc: liên cầu, phế cầu, Listeria, Neisseria ...).
* Nội dung
Bệnh phẩm: Chủng thuần, được nuôi cấy qua đêm 18 – 24 h, hoặc tăng sinh
2 – 6 h
* Kỹ thuật tiến hành
Pha huyền dịch vi khuẩn
+ Trên mặt thạch phân lập, chọn ít nhất từ ba đến năm khuẩn lạc vi khuẩn giống nhau và tách rời. Dùng que cấy chạm vào đầu mỗi khuẩn lạc vi khuẩn rồi cấy chuyển vào 4 đến 5ml mơi trường lỏng thích hợp như tryptic soy broth.
+ Ủ canh cấy lỏng này ở 370 C cho đến khi đạt được hay hơn độ đục chuẩn MacFarland 0,5 (thường từ 2 đến 6 giờ). Huyền dịch vi khuẩn như vậy có chứa khoảng 1 - 2 x 108 CFU/ml.
+ Dùng môi trường lỏng hay nước muối sinh lý vô khuẩn để điều chỉnh độ đục của canh cấy vi khuẩn đang tăng trưởng này đến độ đục chuẩn MacFarland 0,5 bằng máy đo độ đục.Pha huyền dịch vi khuẩn trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn.
Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên, ép và xoay nhẹ que tăm bông trên thành ống nghiệm.
Ria đầy vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Muller-Hinton đã để tủ ấm trước đó 10 - 15 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vị trí để đĩa trên máy, đặt tăm bơng vào tâm đĩa thạch, bật máy, từ từ kéo tăm bông từ tâm ra ngồi rìa đĩa thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông. Làm như vậy khoảng 3 lần rồi tắt máy lấy đĩa thạch ra.
Hé nắp hộp thạch đã ria vi khuẩn trong vòng 3 đến 5 phút, nhưng không
quá 15 phút, để cho khô mặt trước khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch.
Đặt khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch đã ria vi khuẩn
Tùy theo chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ, chọn bộ khoanh giấy kháng sinh thích hợp để đặt lên mặt thạch. Khi đặt, phải ép nhẹ mỗi khoanh giấy đó đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch bằng kim lấy máu, mỗi đĩa 7 khoanh giấy kháng sinh, cách nhau 20 mm và cách thành đĩa 15 mm. Kháng sinh khuếch tán sau khi khoanh giấy kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy khơng được dời chỗ các khoanh giấy kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch.
Ủ đĩa thạch trong tủ ấm
Trong vòng 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, các đĩa thạch phải được lật úp để trong tủ ấm với nhiệt độ thích hợp. Đối với những vi khuẩn khó mọc, phải cho đĩa thạch vào tủ ấm có CO2.
* Kết quả:
Đọc kết quả: sau 24 - 48 giờ, trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các vòng tròn
khơng có vi khuẩn phát triển (vịng vơ khuẩn) ở mỗi đĩa kháng sinh. Đo đường
kính của vịng vơ trùng để xác định tính nhậy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
đó, nếu:
- Đường kính ≤ 11 mm: kháng. - Đường kính 12-15 mm: trung bình. - Đường kính ≥ 16 mm: nhậy.