khuấy (ho c lắc đều sau mỗi 15 phút) đểđảm bảo cho s khuyếch tán tốt. L c g n lấy phần d ch chiết rồi tiếp tục l c qua giấy l c trên ph u Buchle. L p l i 4 lần, lần đầu dùng 10 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 5 lít ethanol. Gộp các d ch chiết và cất lo i ethanol dưới áp suất giảm ta đư c t ng cao ethanol. Cân xác đnh khối lư ng cao thu đư c và tính % khối lư ng cao chiết so với khối lư ng mẫu ban đầu.
c. Tính toán kết quả: Hàm lư ng các cao phân đo n tách từ t ng cao
ethanol đư c tính theo công thức:
2.2.2. Ph ng pháp chi t l ng - l ng tách các phơn đo n cao t t ng cao
ethanol
a. Mục đích: Dùng các dung môi có tính phân c c khác nhau để phân tách
và thu nhận các lo i cao chứa các nhóm h p chất có độ phân c c khác nhau từ t ng cao ethanol (chứa hầu như tất cả các h p chất hữu cơ của trong cây Náng hoa trắng).
b. Cách tiến hành: Lấy cao ethanol (khoảng 100g) thu đư c đem phân tán
vào 200ml nước cất (vì cao ethanol khó tan ngay trong nước nên ban đầu ta hòa nhuy n b ng 20ml ethanol 960, sau đó thêm dần nước, dùng đũa thủy tinh hay thìa
% mcao ethanol = mcao ethanol x 100 mmẫu dư c liệu khảo sát
inox lo inh khuấy đều để cao phân tán đều trong nước) rồi cho vào bình thủy tinh có nút kín lo i 1 lít. Sau đó tiến hành chiết l ng - l ng lần lư t với 3 dung môi có độ phân c c tăng dần là hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Mỗi lo i dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi, thời gian lắc chiết mỗi lần là 3 giờ nhiệt độ phòng. Sau khi chuyển vào ph u chiết, khi thấy tách lớp hoàn toàn (chừng 1 ậ 2 giờ), chiết riêng phần dung môi và phần d ch nước, xác đ nh thể tích phần dung môi (b ng ống đong), cho vào chai chứa lo i 500ml, làm khan b ng cách thêm vào 1 thìa Na2SO4 khan, lắc nhẹ, để lắng rồi trích mẫu thử. Gộp d ch chiết của cả 3 lần (với từng dung môi), cô đu i dung môi dưới áp suất thấp thu đư c phân đo n cao hexane, cao dichloromethane, cao ethyl acetate và cao nước từ cao t ng ethanol.
c. Tính toán kết quả: Hàm lư ng các cao phân đo n tách từ t ng cao
ethanol đư c tính theo công thức:
2.3. Đ NH TệNH NHịM CH T B NG CỄC THU C TH Đ C TRƯNG
Các nhóm chất trong các phân đo n cao tách từ t ng cao ethanol đư c đ nh tính b ng các thuốc thử hóa h c như sau:
2.3.1. Đ nh tính alkaloid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml HCl, khuấy đều, l c qua giấy l c, lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml.
ng 1: thêm vào 1-2 gi t thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính
ng 2: thêm vào 1-2 gi t thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
ng 3: thêm vào 1-2 gi t thuốc thử Wagner, nếu xuất hiện kết tủa màu cam nâu là phản ứng dương tính.
2.3.2. Đ nh tính flavonoid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml methanol, đun nóng cho tan và l c qua giấy l c. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml d ch l c.
% mcao phân đo n= mcao phân đo n x 100 mcao ethanol
ng 1: Thêm vào 1-2 gi t H2SO4 đậm đ c, đun trong bình cách thủy vài phút. Dung d ch xuất hiện màu đ ho c hồng là phản ứng dương tính.
ng 2: Thêm vào 1-2 gi t NaOH 1%/etanol, nếu xuất hiện màu đ đậm ho c đ tím thì phản ứng dương tính.
ng 3: thêm vào 1-2 gi t AlCl3/etanol 1%, nếu xuất hiện màu xanh lục là phản ứng dương tính.
2.3.3. Đ nh tính sesquiterpen-lacton
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml chloroform, khuấy đều, l c qua giấy l c, lấy vào ống nghiệm 5ml d ch l c, thử b ng thuốc thử Tollen, nếu có lớp gương b c bám trên thành ống nghiệm ho c có kết tủa Ag màu đen dưới đáy ống nghiệm thì phản ứng dương tính.
2.3.4. Đ nh tính steroid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml clorofom, khuấy đều, l c qua giấy l c. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml d ch l c.
ng 1: Thêm vào 1-2 gi t H2SO4 đậm đ c, nếu dung d ch đ i sang màu đ đậm ho c xanh tím thì phản ứng dương tính.
ng 2: Thêm vào 2 gi t dung d ch vanillin 1% trong etanol, 1 gi t HCl đậm đ c. Nếu dung d ch chuyển sang màu xanh lục ho c tím thì phản ứng dương tính.
2.3.5. Đ nh tính ch t béo
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm vào 15ml ethanol, khuấy đều, l c qua giấy l c, thêm vào 1-2 gi t H2SO4 50% trong methanol. Nếu xuất hiện màu nâu đen ho c đ tía thì phản ứng dương tính.
2.3.6. Đ nh tính glycoside
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 2ml dd NaOH 10%, đun cách thủy đến khô. Hòa tan c n trong 5ml chloroform. Lấy d ch clorofom để làm phản ứng đ nh tính.
Phản ứng Keller-Kilian: thuốc thử gồm 100ml axit axetic loãng + 1ml Fe2(SO4)3 5%.
Cách tiến hành: thêm vào mẫu thử 1ml dung d ch thuốc thử, 1-2 gi t H2SO4 đậm đ c. Nếu xuất hiện màu xanh lục sau 1-2 phút thì phản ứng dương tính.
2.3.7. Đ nh tính h p ch t phenol
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, l c qua giấy l c. Lấy vào 3 ống nghiệm mỗi ống 5ml d ch l c.
ng 1: thêm vào 1-2 gi t thuốc thử Bortrager (KOH 50%/methanol). Nếu xuất hiện màu đ , tím ho c xanh lục thì phản ứng dương tính.
ng 2: Thêm vào 1ml dung d ch FeCl3 5% trong ethanol. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đ thì phản ứng dương tính.
ng 3: Thêm vào 1ml formol 36%, 1-2 gi t HCl đậm đ c. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đ thì phản ứng dương tính.
2.4. CỄC PHƯ NG PHỄP S C KÝ 2.4.1. S c ký b n m ng 2.4.1. S c ký b n m ng
a. Mục đích: Sắc ký bản m ng là một kĩ thuật đư c dùng để đ nh tính, thử
độ tinh khiết, tách chất trong hỗn h p và đôi khi để bán đ nh lư ng các ho t chất.