b. Cách tiến hành
2.4.2.Ph ng pháp sc ký ct
a. Mục đích: Sắc ký cột dùng để tách các chất (cấu tử) ra kh i hỗn h p d a
vào tính phân c c của từng chất.
b. Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cột sắc ký, bình hứng, chất hấp thu và mẫu cao
Chuẩn bị cột sắc ký: Tùy theo lư ng cao mà sử dụng cột sắc ký thích h p
Hình 2.5. Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột
(a): d= 5cm và h= 50cm; (b): d = 1.5cm và h = 45cm; (c): d = 1.0cm và h = 45cm Với lư ng cao ban đầu chừng 10gam thì dùng côt sắc ký có đường kính ngoài 3,5cm và chiều cao làm việc cột là 50cm, lư ng silica gel cho vào cột là 135gam, dung môi n đ nh là hexane. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để ch n thì có thể dùng bông thủy tinh để ch n silicagel không b chảy xuống khi giải ly.
Chuẩn bị bình hứng:
Hình 2.6. Các bình hứng dung dịch giải ly
Chuẩn bị chất hấp thu silica gel: chất hấp thu d ng sệt đư c chu n b như
sau: cho chất hấp thu vào Trong một becher đã có s n dung môi, mỗi lần một lư ng nh , vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lưu ý không đư c th c hiện ngư c l i, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu b i vì chất hấp thu g p dung môi s phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, s không đồng nhất. Lư ng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn h p không đư c quá sệt s khiến cho b t khí b giữ l i trong cột và cũng không đư c quá loãng.
Chuẩn bị mẫu: nếu mẫu d ng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lư ng nh dung môi thích h p như methanol/ethanol rồi trộn với một lư ng silica gel tương đương. Làm bay hơi dung môi ban đầu b ng để khô t nhiên (ho c cô quay chân không) và làm khô trong bình phòng m chừng qua đêm(đư cbột silica gel đã t m mẫu d ng khô). Lấy ra, nghiền m n b ng cối chày sứ lo i nh , để khô l i trong bình phòng m trước khi dùng. Khi đó mẫu cần sắc ký đã đư c trải đều và gắn ch t lên bề m t các h t silica gel.
Bước 2: Đưa chất hấp thu lên cột (nhồi cột)
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi hexane (lo i kém phân c c nhất) vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Dùng thìa inox cho chất hấp thu vào trong cột, đều đ n các phía, mỗi lần một lư ng nh , khi lư ng chất cho vào cột mỗi lần cao thêm khoảng 2cm thì gõ nhẹ đều vào thành cột cả 4 phía. Khi lớp dung môi dâng cao cách miệng cột chừng 10cm thì m nhẹ khoá bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra (hứng vào một bình hứng phía dưới cột và dung môi này s đư c rót l i lên đầu cột). Sau khi n p xong, m t thoáng chất hấp thu đầu cột phải n m ngang.
Nếu m t thoáng không n m ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng thìa inox thẳng g t xoay nhẹ để làm phẳng lớp chất hấp thu phần trên đầu cột. Tiếp tục cho dung môi chảy qua chất hấp thu (hứng lấy và cho lên tr l i)vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có d ng đồng nhất.
Bước 3: Đưa mẫu lên cột
+ Với mẫu khô, m khoá cho dung môi chảy ra kh i cột để h mức dung môi trong cột xuống sao cho lư ng dung môi đủ để thấm ướt hoàn toàn lư ng mẫu cho vào. Đóng khoá l i, để bắt đầu n p mẫu vào đầu cột: dùng thìa inox lo i nh mức từng thìa cho vào cột qua một ph u hứng thủy tinh cho đến khi hết. Cần canh chừng không cho mẫu và chất hấp thu đầu cột b khô. Cho thêm một lớp silica gel s ch lên trên m t thoáng của mẫu, dùng bông thủy tinh, bông gòn hay giấy l c đ t nhẹ lên m t thoáng chất hấp thu để bảo vệ m ttrên củacột.
Hình 2.8. Cộtsắc ký sau khi đưa mẫu lên cột
+ Nếu mẫu ướt, m khoá cho dung môi chảy ra kh i cột để h mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với m t thoáng của chất hấp thu trong cột. Sử dụng một pipet hút dung d ch mẫu chất, đ t đầu pipet gần sát m t thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet d c quanh thành cột cho dung d ch chảy ra theo thành trong của cột, ch m xuống bề m t chất hấp thu. M khoá bên dưới cho dung môi chảy ra kh i cột, làm cho dung d ch mẫu đư c thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột (cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột b khô). Dùng pipet cho một lu ng nh dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa s ch ống mà dung d ch dính trên thành cột. L p l ivài lần giúp cho dung d ch mẫu thấm sâuvào chất hấp thu.
Bước 4: Chạy sắc ký cột (giải ly sắc ký cột)
Sử dụng kết quả bản m ng để l a ch n dung môi giải ly phù h p (dung môi làm cho các chất có m t trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất
một cách g n, rõ, sắc nét và v trí các vết n m khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký). Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Khi sử dụng pha tĩnh là silica gel lo i thường, h p chất không phân c c đư c giải ly kh i cột trước, h p chất phân c c đư c giải ly sau. Với 2 phân tử không phân c c, phân tử nào có tr ng lu ng phân tử lớn s có tính phân c c m nh hơn phân tử kia, nó b pha tĩnh giữ l i trong cột nên di chuyển ra kh i cột chậm hơn so với các phân tử nh , và cũng có khi nó l i lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân c c.
Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: ch sử dụng đơn dung môi ho c hỗn h p dung môi nhưng trong hỗn h p t lệ giữa các thành phần không thay đ i, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn.
Giải lycó nồng độ tăng dần: đôi khi việc sử dụng một dung môi s ch giải ly ra kh i cột một số cấu tử nhất đ nh nào đó và một số cấu tử khác tính phân c c hơn vẫn còn n m đầu cột. Nếu muốn lấy chúng ra kh i cột phải dùng một dung môi có l c m nh hơn. Trong quá trình sắc ký, cần thay đ i nhiều lo i dung môi khác nhau, có l c m nh tăng dần để có thể đu i hết các cấu tử khác nhau ra kh i cột. Muốn tăng tính phân c c cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm. Nếu tăng tính phân c c nhanh, đột ngột s làm “gãy’ cột. Cột “gãy” s làm mất đi s liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt đư c.
Dung d ch giải ly đư c hứng trong các bình thủy tinh nh có đánh số thứ t trước. Hứng mỗi l một thể tích như nhau, thường là 15ml. Dung d ch trong những l hứng đư c s đư c cho bay hơi bớt dung môi rồi tiến hành kiểm tra vết chất b ng sắc ký bản m ng. Những l nào có vết sắc ký giống nhau s đư c gom l i với nhau thành một phân đo n. Đu i dung môi áp suất thấp s thu đư c cao của phân đo n đó.
Bước 5: Chọn phân đoạn để tiếp tục khảo sát
Ch n phân đo n có lư ng cao nhiều và có h p chất cần phân lập để tiếp tục khảo sát. Các phân đo n có lư ng cao ít, nhiều t p chất, bản m ng có nhiều vết mờ, dính với nhau ho c kéo đuôi rất khó khảo sát tiếp, vì nếu cô lập đư c chất tinh khiết s không đủ lư ng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa h c b ng các phương pháp hóa lý hiện đ i.