Lượng glucid tổng trong nước ép củ nén được xác định bằng phương pháp Ferry cyanure [3].
Nguyên tắc
Khi cho ferry cyanure (K3Fe(CN)6) phản ứng với đường khử, có mặt dung dịch NaOH sản phẩm thu được là ferro cyanure. Từ phản ứng này, có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm, khi đun nóng với chỉ thị Methylen blue. Phương trình phản ứng:
CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH CH2OH-(CHOH)4- COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O.
Cách tiến hành: Phụ lục
Tính kết quả: Phụ lục
2.2.2.2. Xác định hàm lượng nitơ tổng số[18] Nguyên tắc
Dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ (N) bị phân hủy và bị oxi hóa thành CO2, H2O, còn nitơ tạo thành NH3, và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat.
- Vô cơ hóa nguyên liệu:
NH2-CH2COOH + 3 H2SO4 NH3 + 2CO2 + 4H2O
- Khí amoniac sinh ra sẽ kết hợp ngay với H2SO4 dư tạo thành 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
Amoniac sunfat amoni
Đốt thực phẩm trong bình Kjeldahl. Sau khi vô cơ hóa xong, làm lạnh bình rồi thêm một lượng natri hydroxyt để đẩy amoniac ra :
(NH4)2SO4 + NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
Cất amoniac và dùng acid sulfuric hấp thụ. Từ lượng acid sunfuric đã kết hợp với amoniac, tính ra được amoniac, sau đó tính được lượng nitơ. Lượng nitơ được nhân với 6.25, sẽ ra được lượng protein toàn phần.
Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm, thành phố Huế.
2.2.4. Phương pháp hóa lý
2.2.4.1. Xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng
Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm, thành phố Huế.
Theo phương pháp F-AAS
2.2.4.2. Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS
Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS là phương pháp phân tích dựa trên kết quả so sánh giữa khả năng hấp thụ năng lượng (tia) bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Phương pháp UV/VIS cho phép xác định hợp chất có khối lượng nhỏ, lại tốn ít thời gian so với các phương pháp khác nhưng kết quả đo có độ chính
xác cao. Phương pháp này còn có thể áp dụng để phân tích định tính bởi mỗi dung dịch màu chỉ hấp thụ những tia sáng có bước sóng nhất định.
Cơ sở lý thuyết của phương pháp
Cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS dựa trên định luật Lambert- Beer.
Khi năng lượng (tia) bức xạ đơn sắc đi qua dung dịch chứa chất hấp thụ thì cường độ của tia ló bức xạ có xu hướng giảm mạnh nếu có càng nhiều phân tử hấp thụ được năng lượng bức xạ. Sự giảm cường độ phụ thuộc vào nồng độ chất hấp thụ và độ dài đoạn đường mà bức xạ đơn sắc đi qua.
Định luật Lambert- Beer có thể biểu diễn bởi phương trình sau: D=lg D lgI0
I
ε.C.l Trong đó:
I0: Cường độ ánh sáng tới
I: Cường độ ánh sáng sau đi khi qua dung dịch C: Nồng độ dung dịch (mol/l)
l:Bề dày lớp dung dịch (cm)
ε: Hệ số tắt phân tử, phụ thuộc vào bản chất của dung dịch màu, bước sóng của bức xạ đi qua và nhiệt độ.
D: Mật độ quang (hay độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch)
Đối với dung dịch nhất định chứa trong một loại cuvet nhất định thì ε,l là cố định do vậy D=kC cho biết sự phụ thuộc tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ của dung dịch, đây chính là cơ sở của phương pháp phân tích định lượng.
2.2.4.3 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS )
Nguyên tắc:
với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.Được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Bản chất của phương pháp GC/MS, là sự kết hợp của Sắc ký khí và Khối phổ, ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram.
Nhờ có khí có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện.Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.
Cách tiến hành: Mẫu được đo tại trung tâm đo lường chất lượng 2 (thành phố Đà Nẵng)
2.2.5. Phương pháp vi sinh vật
Dùng để xác định khả năng kháng khuẩn vi sinh vật kiểm định của dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch bằng cách đo đường kính vong thủy phân
Nguyên tắc :
Nuôi cấy một số chủng vi khuẩn dùng kiểm định trong môi trường TSA. Pha loãng mẫu thử và thử khả năng kháng khuẩn của mẫu bằng cách đo đường kính vòng thủy phân xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường TSA.
Cách tiến hành: Mẫu được xác định tại trung tâm đo lường Sắc kí Hải Đăng thành phố Hồ Chí Minh
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định một số thành phần hóa học có trong củ nén
Một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất của quá trình chiết tách phytolcid cũng như ảnh hưởng đến công đoạn tinh sạch dịch chiết đó là sự hiện diện của các cấu tử có trong dịch chiết đặc biệt là thành phần nước. Ngoài ra trong thành phần hóa học của nén còn có glucid, các nguyên tố kim loại…Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định một số thành phần hóa học và các nguyên tố kim loại sau:
+ Hàm lượng nước
+ Hàm lượng gluxid tổng + Hàm lượng protein
+ Hàm lượng các nguyên tố: canxi, natri, kali, magie
Kết quả xác định một số thành phần hóa học và các nguyên tố vi lượng chính của củ nén tươi được trình bày trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số thành phần hóa học của củ nén ở Quảng Nam
Thành phần Đơn vị tính Hàm lượng
Hàm lượng nước % khối lượng 86,3
Glucid tổng %(CK) 6,53 Protein %(CK) 1,59 Canxi % CK 0,04 Kali % CK 0,25 Magie % CK 0,03 Natri % CK 0,02 Nhận xét:
- Hàm lượng nước của các nguyên liệu tươi nằm trong khoảng 86,3% là hoàn toàn phù hợp với hàm lượng nước đã được công bố trên tài liệu [37].
Mục tiêu xác định hàm lượng nước ban đầu có trong nguyên liệu tươi nhằm mục đích sau: Trong quá trình chiết tách đối với nguyên liệu tươi, hàm lượng nước có trong nguyên liệu là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách. Lượng nước lớn sẽ gây ra sự dính bết giữa các phân tử khác nhau chứa trong nguyên liệu. Nước trong nguyên liệu sẽ liên kết giữa protein với các thành phần háo nước khác (gluxit, khoáng…), làm ngăn cản sự thẩm thấu của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán và đối lưu của phân tử, do đó làm giảm hiệu suất chiết tách [17]. Để nâng cao hiệu suất chiết tách các hợp chất mong muốn từ nguyên liệu tươi, rất cần phải loại bỏ hoàn toàn nước ra khỏi nguyên liệu trước khi tiến hành chiết tách. Vì vậy trong quá trình xử lý và làm nhỏ nguyên liệu người ta thường bổ sung một lượng chất hút ẩm phù hợp (Na2SO4) để loại nước. Khối lượng chất hút ẩm cần dùng tùy thuộc vào khối lượng và độ ẩm của nguyên liệu chiết tách. Theo A.F.Nametnhicov [12], đối với loại chất hút ẩm Na2SO4, khối lượng chất hút ẩm cần dùng là 40- 45g Na2SO4 / 5 g nguyên liệu tươi.
Mặt khác, bất kỳ một quá trình chiết tách nào (đặc biệt là dùng dung môi để chiết tách) thì vấn đề xác định nồng độ thích hợp của dung môi chiết tách có thể được xem là yếu tố tiên quyết quyết định đến hiệu suất thu hồi sản phẩm chiết. Do đó, để bảo đảm sử dụng dung môi theo nồng độ đã định, hàm lượng nước ban đầu (hoặc còn gọi là hàm ẩm của nguyên liệu chiết tách) là tham số rất quan trọng để điều chỉnh nồng độ dung môi phù hợp cho mục tiêu đạt hiệu quả cao khi tiến hành chiết.
- Hàm lượng glucid tổng trong củ nén ở Quảng Nam là xấp xỉ với hàm lượng gluxid tổng trong thành phần hóa học của củ nén theo tài liệu [7]. So với hàm lượng glucid trong củ tỏi thì hàm lượng glucid trong củ nén thấp hơn
nhiều ở tỏi thành phân glucid chiếm 40%..
- Protein là một thành phần dưỡng chất quan trọng nhưng lại là thành phần không có lợi cho quá trình chiết tách. Nhưng trong củ nén thì hàm lượng protein không đáng kể. Do vậy không ảnh hưởng nhiều đến quá trình chiết tách.
- Kết quả phân tích hàm lượng, các nguyên tố vi lượng trong củ nén cho thấy: hàm lượng các nguyên tố Ca, K, Na, Mg, so với họ hành tỏi là gần bằng nhau [7],[9]. Với các thành phần trên có thể xếp nén vào họ hành tỏi.
Từ lâu, trong dân gian người ta thường sử dụng nén làm gia vị, chữa các bệnh do thời tiết… hiệu quả song chưa có những minh chứng cho thấy củ nén có được những công dụng đó là do trong củ nén có chứa hợp chất phytolcid – kháng sinh thực vật nên những nghiên cứu sau sẽ giúp chứng minh những điều cần biết về giá trị dược lý của củ nén.
3.2. Xác định một số cấu tử của hỗn hợp chiết
Theo tài liệu [6],[22] đã công bố về tỏi và một số loài thuộc họ hành tỏi đã chứng minh được trong thành phần của các loài thuộc họ hành tỏi có chứa các hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao. Mà nén cũng thuộc họ hành tỏi nên để xác định xem trong nén có các hợp chất có khả năng kháng khuẩn như họ hành tỏi hay không nên tôi tiến hành xác định cấu tử trong dịch chiết củ nén.
Dựa theo tài liệu nghiên cứu [15],[16] về xác đinh một số thành phần của tỏi. Mà nén cũng thuộc họ hành tỏi nên tôi áp dụng quy trình ngâm chiết tỏi đối với nén: tiến hành ngâm chiết củ nén giã nát trong dung môi cồn 960
với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 80/10(ml/g) thời gian ngâm là 30 ngày và ở nhiệt độ 200C, pH=7. Sau khi chiết rút hỗn hợp dịch chiết được tiến hành định danh các cấu tử bằng phương pháp GC/MS.
Từ các kết quả phân tích phổ GC-MS, một số cấu tử chính có trong dịch chiết củ nén được trình bày ở bảng
Bảng 3.2. Một số hợp chất phytoncid có trong dịch chiết củ nén STT Thời gian lưu Phần trăm (%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 4.161 1.01 1,2-benzenediol 2 4.516 8.85 4-mecaptophenol 3 5.146 0.78 1,2-benzenediol,4 – methyl 4 5.728 0.15 Allicin 5 8.169 0.42 Dialyl disulfide 6 12.450 1.2 n- hexadecanoic acid
7 12.775 0.32 hexadecanoic acid ethyl ester 8 17.230 0.66 Hexadecanoic acid,2- hydroxy - 1-(hydroxy metyl)ethyl ester O C2H5 O OH 9 18.637 1.54 9,12- octadecadienoic acid (z,z)-,2- hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethyl ester Từ kết quả phổ hình 3.1 và bảng 3.2 đã xác định được thành phần một số phytoncid chủ yếu có trong dịch chiết củ nén: 1,2-benzenediol, 4- mecaptophenol, 1,2-benzenediol-4–methyl; Allicin; Diallyl disulfide; n- hexadecanoic acid; hexadecanoic acid ethyl ester; Hexadecanoic acid,2- hydroxy -1-(hydroxy metyl)ethyl ester; 9,12-octadecadienoic acid (z,z)-,2- hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester.
So với thành phần hóa học trong củ tỏi ở tài liệu [9],[24] đã công bố trong thành phần hóa học của tỏi cũng có chứa allicin; diallyl disulfide; Ajoen; diallyl trisulfid… Và cũng chứng minh được allicin, diallyl disulfide; ajoen là những hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao có tính chất quyết định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi. Nên tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi allicin và diallyl disulfide. Mặt khác xét về mặc tính chất thì allicin là chất không màu, dễ bị oxy hóa làm cho hoạt tính kháng khuẩn giảm đi nhiều. Còn diallyl disulfide là chất có màu, bền hơn
allicin. Bằng phương pháp đo quang phổ có thể xác định được hàm lượng của diallyl disulfide ở λmax = 240nm [28],[33]. Để chứng minh xem với điều kiện ngâm chiết tỏi có phải là tối ưu đối với củ nén hay không nên tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi phytolcid mà cụ thể là diallyl disulfide.
3.3. Chọn dung môi chiết tách các phytolcid chủ yếu trong củ nén
Dung môi có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình chiết tách, nó phụ thuộc rất lớn vào khả năng thẩm thấu của dung môi qua lớp vỏ của tế bào, khả năng hòa tan có chọn lọc các hoạt chất khi vào bên trong tế bào và sau cùng là khả năng di chuyển của dung môi đã hòa tan chất chiết đi qua nhiều lớp cấu trúc của nguyên liệu. Vì vậy lựa chọn dung môi là một trong những yếu tố có vai trò quyết định đến hiệu suất thu hồi chất cần chiết tách. Nếu lựa chọn dung môi phù hợp sẽ nâng cao hiệu quả của quá trình chiết tách. Thông thường yêu cầu dung môi phải hòa tan tốt các cấu tử cần chiết, nếu cấu tử cần chiết có cấu tạo phân cực thì phải chọn dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol... Ngược lại nếu cấu tử cần chiết không phân cực thì phải lựa chọn dung môi không phân cực như benzen, n- hexan, ete dầu hỏa, cồn cao độ... Dựa trên các tư liệu [39], [40] cho thấy củ nén chứa 2 hợp chất mang đặc tính sinh học có trong họ hành tỏi đó là: Diallyl disulfide, allicin.
Diallyl disulfide là hợp chất hữu cơ không phân cực, nên tiến hành chiết tách diallyl disulfide trong dung môi hữu cơ không phân cực (n- hexan, ete dầu hỏa, axeton, cồn 960).
Các dung môi được khảo sát có nhiệt độ sôi chênh lệch khác nhau, theo tài liệu [15],[16] và dựa vào tính chất của một số phytolcid có trong dịch chiết nên tôi chọn chế độ khảo sát ở điều kiện nhiệt độ 200C.
Hình 3.2. Sơ đồ ngâm chiết một số phytolcid với các loại dung môi
Thuyết minh
Lần lượt cân 10g mẫu đã được xử lý, giã nát và bổ sung thêm 80g Na2SO4 cho vào 4 bình cầu chứa sẵn 80ml dung môi [12] (được đánh số thứ tự từ 1-4):
Bình 1: chứa ete dầu hỏa Bình 2: chứa n- hexan Bình 3: chứa axeton Bình 4: chứa cồn 960
Tiến hành ngâm 4 mẫu trên ở nhiệt độ 200C trong thời gian 30 ngày. Thu dịch chiết, đo giá trị mật độ quang bằng phương pháp UV- VIS ở bước sóng λmax = 240nm. Xác định được độ hấp phụ.
Để thấy được sự biến thiên giá trị mật độ quang diallyl disulfide thu được ở các loại dung môi khác nhau. Giá trị mật độ quang diallyl disunfide được biểu diễn trên hình 3.3
Củ nén đã xử lí
Ete dầu n- hexan axeton cồn 96
Ngâm chiết t0=200C, τ =30 ngày
Đo quang λmax =240nm
Giá trị mật độ quang thu được 1.2004 1.0573 0.9732 0.8698 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 ete dầu hỏa n-hexan axeton cồn 96 D ung môi G iá t rị m ậ t đ ộ q u a n g t h u đ ư ợ c c ủ a d ia ll y l d is u lf id e
Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.3. So sánh hiệu quả chiết diallyl disulfide từ củ nén ở Quảng Nam bằng dung môi hữu cơ khác nhau trong cùng điều kiện
Nhận xét:
Từ hình 3.3, cho thấy : Khi chiết với các loại dung môi khác nhau thì hàm lượng diallyl disulfide thu được cũng hoàn toàn khác nhau. Khi sử dụng dung môi là ete dầu hỏa, n- hexan, axeton, cồn 960 cho giá trị mật độ quang thu được lần lượt là: 1,2004; 1,0573; 0,9732; 0,8698..
Cụ thể khi chiết với axeton giá trị mật độ quang thu được gấp 1.12 lần so với chiết với cồn 960C, chiết bằng ete dầu hỏa cho giá trị mật độ quang cao nhất và gấp 1,38 lần so với khi dùng dung môi là cồn 960C. Từ kết quả thu