phytolcid chủ yếu từ củ nén
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tươi (ml/g) đến hiệu suất chiết tách
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết diallyl disulfide. Về mặt lý thuyết khi tỉ lệ này càng lớn thì hiệu quả chiết tách càng cao. Tuy nhiên trong thực tế, tùy theo đặc điểm của mỗi loại nguyên liệu
rất cần xác định tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi cụ thể để vừa đạt hiệu suất chiết tách cao, vừa tiết kiệm dung môi. Hơn nữa nếu dùng tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi quá lớn cũng gây khó khăn cho công đoạn tinh chế sản phẩm sau này. Bởi nhiệt độ chiết kéo dài làm cho các chất khác có điều kiện hòa tan vào dung môi gây hiệu suất chiết tách không cao mà làm nhiều cơ chất không mong muốn lẫn vào dịch chiết.
Trong nghiên cứu này, nguyên liệu được sử dụng để chiết diallyl disulfide là nguyên liệu tươi. Độ ẩm trong nguyên liệu cũng gây ảnh hưởng đến tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu, vì nước có trong nguyên liệu sẽ ngăn cản sự thấm của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán của dung môi vào bên trong nguyên liệu. Do vậy để đảm bảo hiệu quả chiết tách cao trong quá trình xử lý, cần nghiền nhỏ nguyên liệu và bổ sung 80 g Na2SO4/10 g nguyên liệu tươi [17]
Để khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi đến hiệu quả chiết diallyl disulfide, tôi tiến hành khảo sát ở các tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi như sau: 50/10 ; 60/10 ; 70/10 ; 80/10; 90/10; 100/10 (ml/g).Các thí nghiệm được bố trí như trên sơ đồ hình 3.4.
Các thí nghiệm được tiến hành như sau: Cân 6 mẫu nén đã được sơ chế và giã nát với khối lượng mỗi mẫu là 10 gam, bổ sung thêm 80 g Na2SO4. Tất cả được cho vào 6 bình cầu đánh số sẵn (từ 1-6). Sau đó tiếp tục cho dung môi cồn 960 vào mỗi bình lần lượt như sau:
Bình 1: 50ml Bình 2: 60ml
Bình 3: 70ml Bình 4: 80ml
Bình 5: 90ml Bình 6: 100ml
Tiến hành ngâm ở nhiệt độ 200C trong thời gian 30 ngày. Dịch chiết sau đó được đo UV-VIS ở bước sóng (λ) 240 nm để xác định giá trị mật độ quang thu được.
Hình 3.4. Sơ đồ thí nghiệm chiết hỗn hợp phytolcid chủ yếu trong củ nén với tỉ lệ dung môi khác nhau
Để thấy được sự biến thiên giá trị mật độ quang diallyl disulfide thu được phụ thuộc vào tỷ lệ dung môi cồn 960 sử dụng/ nguyên liệu củ nén giã nhỏ, giá trị mật độ quang diallyl disulfide được biểu diễn trên hình 3.5
0.7562 0.7925 0.7683 0.8457 0.8643 0.8259 0.7 0.72 0.74 0.76 0.78 0.8 0.82 0.84 0.86 0.88 50/10 60/10 70/10 80/10 90/10 100/10
T ỉ lệ dung m ôi/ng uyên liệu (m l/g )
G iá t rị m ậ t đ ộ q u a n g t h u đ ư ợ c
Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ dung môi cồn 960/ nguyên liệu củ nén giã nát đến giá trị mật độ quang thu được
Củ nén đã xử lý
50/10 60/10 70/10 80/10
Ngâm chiết t0=200C, τ=30 ngày
Đo quang λmax =240nm
90/10 100/10
Nhận xét:
Kết quả trên đồ thị hình 3.5 cho thấy: khi tăng tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi,nhìn chung hàm lượng diallyl disulfide thu được cũng tăng dần và đạt cực đại khi tỉ lệ này là 80/10 (ml/g). Khi thay đổi tỉ lệ từ 70/10 đến 80/10 thì giá tri mật độ quang diallyl disulfide thu được tăng, khi vượt qua ngưỡng cực đại này thì giá tri mật độ quang diallyl disulfide bắt đầu giảm dần. Như vậy tùy thuộc vào tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi khác nhau mà hiệu suất chiết diallyl disulfide sẽ khác nhau. Khi sử dụng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tươi cao đồng nghĩa với lượng dung môi sử dụng lớn, sẽ giúp hòa tan triệt để lượng diallyl disulfide có trong nguyên liệu làm cho hiệu quả chiết cao.
Ngược lại khi sử dụng tỉ lệ này nhỏ sẽ không đủ dung môi hòa tan hết được diallyl disulfide trong nguyên liệu nên hiệu quả chiết thấp. Tuy nhiên khi đã đạt đến mức độ chiết cao nhất nếu vẫn tiếp tục tăng thể tích dung môi sẽ không mang lại hiệu quả vì lúc đó một số tạp chất cũng bị chiết theo và gây lãng phí dung môi.
Kết quả thí nghiệm khảo sát nêu trên cho hiệu quả chiết diallyl disulfide cao nhất ở tỉ lệ 80/10 (ml/g).
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi diallyl disulfide disulfide
Sau khi lựa chọn được tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tươi cho quá trình ngâm chiết là 80/10 (ml/g) thì nhiệt độ cũng là một yếu tố có vai trò quan trọng không kém, có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của quá trình ngâm chiết .
Tùy thuộc vào tính chất của cấu tử cần chiết và dung môi mà lựa chọn nhiệt độ cho phù hợp. Về nguyên tắc chung: khi tăng nhiệt độ thì hiệu quả chiết tách sẽ cao, tuy nhiên qui luật này không phải luôn luôn là đại lượng tỷ lệ thuận mà là có giới hạn. Khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng
không cần thiết khác làm biến chất cấu tử cần chiết. Ngoài ra nhiệt độ cao còn làm tăng sự hao hụt dung môi dẫn đến hiệu quả kinh tế giảm. Vì vậy, cần phải lựa chọn mức nhiệt độ phù hợp sao cho hiệu quả chiết tách là cao nhất đồng thời hạn chế được những yếu tố bất lợi.
Tiến hành thí nghiệm như sau: Cho lần lượt vào 6 bình cầu, mỗi bình 10 gam củ nén đã được xử lý và 80ml cồn 960. Tiến hành ngâm chiết trong 30 ngày lần lượt ở các mức nhiệt độ : 50C, 100C, 150C, 200C, 250C, 300C. Dung dịch chiết được gia nhiệt bằng thiết bị tự động để đạt nhiệt độ yêu cầu trong thời gian ngâm chiết 30 ngày.
Dịch chiết thu được được xác định giá trị mật độ quang (A) trên thiết bị đo quang UV/VIS.
Các thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 3.6.
Hình 3.6. Sơ đồ thí nghiệm chiết phytolcid ở nhiệt độ khác nhau
Để thấy được sự biến thiên giá trị mật độ quang thu được phụ thuộc vào nhiệt độ chiết, giá trị mật độ quang diallyl disulfide được biểu diễn trên
Củ nén đã xử lý
50C 100C 150C 200C
Ngâm chiết t0=200C, τ = 30 ngày Đo quang λmax =240nm
250C 300C
hình 3.7 0.8274 0.8352 0.8662 0.8675 0.8693 0.8563 0.82 0.83 0.84 0.85 0.86 0.87 0.88 0 5 10 15 20 25 30 Nhiệt độ (oC ) A(nm )
Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiêt đến giá trị mật độ quang của diallyl disulfide
Kết quả ở hình 3.7 cho thấy: Ứng với các nhiệt độ chiết khác nhau cho giá trị mật độ quang thu được cũng có sự khác biệt rõ rệt. Điều đó cho thấy nhiệt độ là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách.
Khi tăng nhiệt độ thì giá trị mật độ quang diallyl disulfide thu được cũng tăng dần và đạt cực đại ở 250C. Tuy nhiên khi nhiệt độ tiếp tục được tăng lên 300C thì giá trị mật độ quang giảm. Nhìn chung giá trị mật độ quang thu được tương đối cao khi nhiệt độ dao động từ 20- 250C.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến kết quả chiết diallyl disulfide có thể được giải thích như sau: Nhiệt độ cao có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt của dung dịch, giúp các phân tử cần chiết dễ dàng khuếch tán trong lòng các phân tử của dung môi do đó, làm tăng tốc độ khuếch tán dẫn đến hiệu quả thu hồi dịch chiết mang cấu tử cần chiết tốt hơn. Mặt khác, nhiệt độ giúp làm biến tính màng tế bào và phá hủy màng tế bào nhờ các bọt khí tạo thành làm cho quá trình chiết tách dễ dàng hơn. Tuy nhiên điều này không có nghĩa là càng tăng nhiệt độ thì hiệu quả chiết tách cũng tăng theo, bởi vì khi nhiệt độ quá cao có thể làm biến đổi tính chất của diallyl disulfide. Nhìn
chung hàm lượng diallyl disulfide thu được tương đối cao khi nhiệt độ dao động trong khoảng 200 – 250C. Mặc khác một hợp chất khác có khả năng kháng khuẩn cao nhất là allicin lại là chất không bền và dễ dàng bị oxy hóa, mất tác dụng ở 250C và nhiệt độ cao hơn.
Theo kết quả nghiên cứu trên tạp chí World Health Organization [29], về thành phần hóa học của củ tỏi khi chiết với dung môi ethanol ở nhiệt độ 00C- 50C trong thành phần chủ yếu là alliin, ở 20- 250C alliin không còn mà chuyển về allicin và diallyl disulfide, ở nhiệt độ cao hơn >250C – <1000C allicin bắt đầu bị oxy hóa chuyển thành diallyl disulfide và 1000C hoàn toàn không còn allicin. Dựa vào kết quả thực nghiệm (hình 3.7), chọn nhiệt độ 200C làm nhiệt độ ngâm chiết cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian
Ngoài các yếu tố: loại dung môi, nhiệt độ, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thì yếu tố thời gian ngâm chiết cũng là một trong những yếu tố tác động không nhỏ đến hiệu suất thu nhận dịch chiết chứa cơ chất cần chiết. Cũng giống như các yếu tố đã nghiên cứu, qui luật khi thời gian tăng thì hiệu suất cũng tăng theo do chất cần chiết có đủ thời gian để khuếch tán vào dung môi. Tuy nhiên không nên kéo dài thời gian chiết quá lâu sẽ là điều kiện tốt cho các hợp chất không mong muốn bị khuếch tán theo làm cho dịch chiết lẫn nhiều cơ chất khác nhau gây trở ngại cho công đoạn tinh sạch cấu tử chiết.
Ngoài ra thời gian chiết kéo dài sẽ gây biến tính sản phẩm chiết do xảy ra các quá trình oxi hóa, ngưng tụ...
Thời gian chiết phụ thuộc vào loại nguyên liệu, dung môi sử dụng và nhiệt độ chiết. Theo nghiên cứu trên tạp chí khoa học và công nghệ [10], [16] để chiết tinh dầu và xác định thành phần hóa học có trong củ tỏi khi sử dụng dung môi cồn 960 thì thời gian ngâm chiết là 30 ngày. Dựa theo nghiên cứu trên, trong thí nghiệm này các khoảng thời gian chiết được khảo sát từ 10
ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày.
Thuyết minh
Tiến hành thí nghiệm với 10 gam củ nén tươi được giã nát chiết bằng 80ml dung môi cồn 960 ở 200C, để nơi tránh ánh sáng chiếu vào và bắt đầu tính thời gian ngâm chiết lần lượt là: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày, 50 ngày, 60 ngày.
Các thí nghiệm được bố trí như trên sơ đồ hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ thí nghiệm tìm thời gian thích hợp để chiết dialyl disulfide.
Để thấy được sự biến thiên giá trị mật độ quang thu được phụ thuộc vào nhiệt độ chiết, giá trị mật độ quang diallyl disulfide được biểu diễn trên hình 3.9
Củ nén đã xử lý
10 ngày 20 ngày 30 ngày 40 ngày
Ngâm chiết t0=200C, τ= 30 ngày
Đo quang λmax =240nm
50 ngày 60 ngày
0.7305 0.8576 0.8693 0.8654 0.8539 0.8422 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 10 20 30 40 50 60
Thời g ian (ng ày) A (nm)
Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu nhận diallyl disulfide
Nhận xét:
Khi tiến hành chiết tách ở các khoảng thời gian khác nhau thì giá trị mật độ quang thu được cũng khác nhau. Trong khoảng thời gian ngâm chiết từ 10- 30 ngày nhìn chung thời gian chiết tăng thì giá trị mật độ quang tăng. Thời gian chiết đến 30 ngày thì giá trị mật độ quang thu được tăng gấp 1,5 lần so với khi ngâm chiết trong thời gian 10 ngày và giá trị mật độ quang đạt cực đại (0,8692) khi chiết trong thời gian 30 ngày.
Khi thay đổi thời gian chiết từ 40- 60 ngày giá trị mật độ quang thu được bắt đầu giảm nhẹ ứng với thời gian ngâm chiết là 40; 50 ngày. Và giảm mạnh ở thời gian 60.
Điều này cho thấy: Thời gian ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu diallyl disulfide khi chiết. Khi thời gian chiết tăng lên trong giới hạn, các cấu tử cần chiết có thời gian để hòa tan và khuếch tán ra khỏi nguyên liệu, do đó khối lượng chất cần chiết thu được sẽ cao. Tuy nhiên mối liên hệ này chỉ tuyến tính trong một giới hạn nhất định, có nghĩa là khi yếu tố ảnh hưởng đạt mức độ cao nhất cho phép đạt hiệu quả chiết tối đa, nếu tiếp tục kéo dài thời gian sẽ gây biến tính các cấu tử cần chiết, vừa gây tổn thất hàm lượng, vừa tạo điều
kiện cho tạp chất cũng hòa tan theo gây bất lợi cho các công đoạn tinh sạch sau này.
Từ kết quả thực nghiệm về thời gian ngâm chiết, tôi chọn thời gian chiết là 30 ngày, là thời gian cho hiệu quả chiết cao nhất.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH
Diallyl disulfide rất bền ở pH kiềm và kém bền ở pH acid. Chính vì thế trong quá trình chiết tách cần chú ý đến đặc điểm này để tránh hiện tượng oxy hóa diallyl disulfide, dẫn đến tổn thất. Mặt khác, môi trường pH cao còn giúp quá trình chuyển hóa allicin thành diallyl disulfide.[15],[34]. Một số nghiên cứu cho rằng: pH kiềm có tác dụng làm tăng hiệu quả quá trình chiết diallyl disulfide, nhưng cũng có những nghiên cứu chứng minh ngược lại rằng: pH hầu như không ảnh hưởng đến hiệu quả chiết diallyl disulfide [34],[37]. Để khách quan hóa những ý kiến trái chiều trên tôi sẽ khảo sát các mức pH=5, pH= 6, pH= 7,pH= 8,pH= 9, pH= 10 để xác định ảnh hưởng của yếu tố này đến hiệu suất chiết diallyl disulfide từ củ nén theo sơ đồ hình 3.10.
Hình 3.10. Sơ đồ ngâm chiết diallyl disulfide ở các giá trị pH khác nhau
Củ nén đã xử lý
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8
Ngâm chiết T0C=200C, τ= 30 ngày
Đo quang λmax=240nm
pH 9 pH 10
Thuyết minh
Tiến hành thí nghiệm với 10 gam củ nén tươi đã qua xử lí được giã nát với 80g Na2SO4 chiết bằng 80ml dung môi cồn 960 ở 200C, trong thời gian 30 ngày, để nơi tránh ánh sáng chiếu vào.
Trong nghiên cứu, tôi sử dụng NaOH và HCl để tạo pH cho vào khối lượng mẫu được chuẩn bị giống như các thí nghiệm phía trước (80ml/10g mẫu). Dùng máy đo pH để kiểm tra giá trị pH như sau: 5; 6; 8; 9;10. Sau đó tiến hành chiết các mẫu này theo sơ đồ hình 3.10.
Đối với mẫu đối chứng (ĐC) có pH 7 cũng tiến hành chiết ở điều kiện tương tự như trên để xác định sự khác nhau về hiệu quả thu hồi diallyl disulfide giữa các mẫu có pH acid, base và mẫu có pH trung tính.
Kết quả ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết diallyl disulfide được thể hiện trên hình 3.11. 0.6831 0.8061 0.8692 0.8702 0.8814 0.8971 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 5 6 7 8 9 10 G iá trị p H A(n m) Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi diallyl disulfide
Dựa theo kết quả trên hình 3.11 cho thấy khi thay đổi giá trị pH trong khoảng từ 5- 10 giá trị mật độ quang tăng lên nhiều so với mẫu không chỉnh pH. Lý do là vì trong môi trường acid diallyl disulfide không bền vững dễ bị
oxy hóa. Ngược lại trong môi trường base allicin không bền phản ứng triệt để nhất tạo thành các diallyl disulfide, vinydithiin... Trong môi trường hơi acid (pH= 5) phản ứng chậm 50 lần [34]. Chính vì vậy khi pH tăng 8- 10 allicin có trong dịch chiết củ nén đã chuyển thành diallyl disulfide nên pH tăng lên giá trị mật độ quang cũng tăng lên và ở pH =10 giá trị mật độ quang cao nhất . Mặc dù vậy song do allicin là một chất có tính kháng khuẩn mạnh nếu để môi trường kiềm sẽ mất đi tính kháng khuẩn của allicin. Do đó, trong nghiên cứu này tôi tiến hành chỉnh pH của dịch chiết về 7.
Qua những nghiên cứu ở trên đã xác định được các điều kiện chiết một số phytolcid chủ yếu có trong dịch chiết củ nén mà cụ thể là diallyl disulfide là:
Dung môi cồn 960 Nhiệt độ chiết 200C Thời gian chiết 30 ngày