Một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất của quá trình chiết tách phytolcid cũng như ảnh hưởng đến công đoạn tinh sạch dịch chiết đó là sự hiện diện của các cấu tử có trong dịch chiết đặc biệt là thành phần nước. Ngoài ra trong thành phần hóa học của nén còn có glucid, các nguyên tố kim loại…Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định một số thành phần hóa học và các nguyên tố kim loại sau:
+ Hàm lượng nước
+ Hàm lượng gluxid tổng + Hàm lượng protein
+ Hàm lượng các nguyên tố: canxi, natri, kali, magie
Kết quả xác định một số thành phần hóa học và các nguyên tố vi lượng chính của củ nén tươi được trình bày trên bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số thành phần hóa học của củ nén ở Quảng Nam
Thành phần Đơn vị tính Hàm lượng
Hàm lượng nước % khối lượng 86,3
Glucid tổng %(CK) 6,53 Protein %(CK) 1,59 Canxi % CK 0,04 Kali % CK 0,25 Magie % CK 0,03 Natri % CK 0,02 Nhận xét:
- Hàm lượng nước của các nguyên liệu tươi nằm trong khoảng 86,3% là hoàn toàn phù hợp với hàm lượng nước đã được công bố trên tài liệu [37].
Mục tiêu xác định hàm lượng nước ban đầu có trong nguyên liệu tươi nhằm mục đích sau: Trong quá trình chiết tách đối với nguyên liệu tươi, hàm lượng nước có trong nguyên liệu là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách. Lượng nước lớn sẽ gây ra sự dính bết giữa các phân tử khác nhau chứa trong nguyên liệu. Nước trong nguyên liệu sẽ liên kết giữa protein với các thành phần háo nước khác (gluxit, khoáng…), làm ngăn cản sự thẩm thấu của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán và đối lưu của phân tử, do đó làm giảm hiệu suất chiết tách [17]. Để nâng cao hiệu suất chiết tách các hợp chất mong muốn từ nguyên liệu tươi, rất cần phải loại bỏ hoàn toàn nước ra khỏi nguyên liệu trước khi tiến hành chiết tách. Vì vậy trong quá trình xử lý và làm nhỏ nguyên liệu người ta thường bổ sung một lượng chất hút ẩm phù hợp (Na2SO4) để loại nước. Khối lượng chất hút ẩm cần dùng tùy thuộc vào khối lượng và độ ẩm của nguyên liệu chiết tách. Theo A.F.Nametnhicov [12], đối với loại chất hút ẩm Na2SO4, khối lượng chất hút ẩm cần dùng là 40- 45g Na2SO4 / 5 g nguyên liệu tươi.
Mặt khác, bất kỳ một quá trình chiết tách nào (đặc biệt là dùng dung môi để chiết tách) thì vấn đề xác định nồng độ thích hợp của dung môi chiết tách có thể được xem là yếu tố tiên quyết quyết định đến hiệu suất thu hồi sản phẩm chiết. Do đó, để bảo đảm sử dụng dung môi theo nồng độ đã định, hàm lượng nước ban đầu (hoặc còn gọi là hàm ẩm của nguyên liệu chiết tách) là tham số rất quan trọng để điều chỉnh nồng độ dung môi phù hợp cho mục tiêu đạt hiệu quả cao khi tiến hành chiết.
- Hàm lượng glucid tổng trong củ nén ở Quảng Nam là xấp xỉ với hàm lượng gluxid tổng trong thành phần hóa học của củ nén theo tài liệu [7]. So với hàm lượng glucid trong củ tỏi thì hàm lượng glucid trong củ nén thấp hơn
nhiều ở tỏi thành phân glucid chiếm 40%..
- Protein là một thành phần dưỡng chất quan trọng nhưng lại là thành phần không có lợi cho quá trình chiết tách. Nhưng trong củ nén thì hàm lượng protein không đáng kể. Do vậy không ảnh hưởng nhiều đến quá trình chiết tách.
- Kết quả phân tích hàm lượng, các nguyên tố vi lượng trong củ nén cho thấy: hàm lượng các nguyên tố Ca, K, Na, Mg, so với họ hành tỏi là gần bằng nhau [7],[9]. Với các thành phần trên có thể xếp nén vào họ hành tỏi.
Từ lâu, trong dân gian người ta thường sử dụng nén làm gia vị, chữa các bệnh do thời tiết… hiệu quả song chưa có những minh chứng cho thấy củ nén có được những công dụng đó là do trong củ nén có chứa hợp chất phytolcid – kháng sinh thực vật nên những nghiên cứu sau sẽ giúp chứng minh những điều cần biết về giá trị dược lý của củ nén.
3.2. Xác định một số cấu tử của hỗn hợp chiết
Theo tài liệu [6],[22] đã công bố về tỏi và một số loài thuộc họ hành tỏi đã chứng minh được trong thành phần của các loài thuộc họ hành tỏi có chứa các hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao. Mà nén cũng thuộc họ hành tỏi nên để xác định xem trong nén có các hợp chất có khả năng kháng khuẩn như họ hành tỏi hay không nên tôi tiến hành xác định cấu tử trong dịch chiết củ nén.
Dựa theo tài liệu nghiên cứu [15],[16] về xác đinh một số thành phần của tỏi. Mà nén cũng thuộc họ hành tỏi nên tôi áp dụng quy trình ngâm chiết tỏi đối với nén: tiến hành ngâm chiết củ nén giã nát trong dung môi cồn 960
với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 80/10(ml/g) thời gian ngâm là 30 ngày và ở nhiệt độ 200C, pH=7. Sau khi chiết rút hỗn hợp dịch chiết được tiến hành định danh các cấu tử bằng phương pháp GC/MS.
Từ các kết quả phân tích phổ GC-MS, một số cấu tử chính có trong dịch chiết củ nén được trình bày ở bảng
Bảng 3.2. Một số hợp chất phytoncid có trong dịch chiết củ nén STT Thời gian lưu Phần trăm (%)
Định danh Công thức cấu tạo
1 4.161 1.01 1,2-benzenediol 2 4.516 8.85 4-mecaptophenol 3 5.146 0.78 1,2-benzenediol,4 – methyl 4 5.728 0.15 Allicin 5 8.169 0.42 Dialyl disulfide 6 12.450 1.2 n- hexadecanoic acid
7 12.775 0.32 hexadecanoic acid ethyl ester 8 17.230 0.66 Hexadecanoic acid,2- hydroxy - 1-(hydroxy metyl)ethyl ester O C2H5 O OH 9 18.637 1.54 9,12- octadecadienoic acid (z,z)-,2- hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethyl ester Từ kết quả phổ hình 3.1 và bảng 3.2 đã xác định được thành phần một số phytoncid chủ yếu có trong dịch chiết củ nén: 1,2-benzenediol, 4- mecaptophenol, 1,2-benzenediol-4–methyl; Allicin; Diallyl disulfide; n- hexadecanoic acid; hexadecanoic acid ethyl ester; Hexadecanoic acid,2- hydroxy -1-(hydroxy metyl)ethyl ester; 9,12-octadecadienoic acid (z,z)-,2- hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester.
So với thành phần hóa học trong củ tỏi ở tài liệu [9],[24] đã công bố trong thành phần hóa học của tỏi cũng có chứa allicin; diallyl disulfide; Ajoen; diallyl trisulfid… Và cũng chứng minh được allicin, diallyl disulfide; ajoen là những hợp chất có khả năng kháng khuẩn cao có tính chất quyết định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi. Nên tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi allicin và diallyl disulfide. Mặt khác xét về mặc tính chất thì allicin là chất không màu, dễ bị oxy hóa làm cho hoạt tính kháng khuẩn giảm đi nhiều. Còn diallyl disulfide là chất có màu, bền hơn
allicin. Bằng phương pháp đo quang phổ có thể xác định được hàm lượng của diallyl disulfide ở λmax = 240nm [28],[33]. Để chứng minh xem với điều kiện ngâm chiết tỏi có phải là tối ưu đối với củ nén hay không nên tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi phytolcid mà cụ thể là diallyl disulfide.
3.3. Chọn dung môi chiết tách các phytolcid chủ yếu trong củ nén
Dung môi có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình chiết tách, nó phụ thuộc rất lớn vào khả năng thẩm thấu của dung môi qua lớp vỏ của tế bào, khả năng hòa tan có chọn lọc các hoạt chất khi vào bên trong tế bào và sau cùng là khả năng di chuyển của dung môi đã hòa tan chất chiết đi qua nhiều lớp cấu trúc của nguyên liệu. Vì vậy lựa chọn dung môi là một trong những yếu tố có vai trò quyết định đến hiệu suất thu hồi chất cần chiết tách. Nếu lựa chọn dung môi phù hợp sẽ nâng cao hiệu quả của quá trình chiết tách. Thông thường yêu cầu dung môi phải hòa tan tốt các cấu tử cần chiết, nếu cấu tử cần chiết có cấu tạo phân cực thì phải chọn dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol... Ngược lại nếu cấu tử cần chiết không phân cực thì phải lựa chọn dung môi không phân cực như benzen, n- hexan, ete dầu hỏa, cồn cao độ... Dựa trên các tư liệu [39], [40] cho thấy củ nén chứa 2 hợp chất mang đặc tính sinh học có trong họ hành tỏi đó là: Diallyl disulfide, allicin.
Diallyl disulfide là hợp chất hữu cơ không phân cực, nên tiến hành chiết tách diallyl disulfide trong dung môi hữu cơ không phân cực (n- hexan, ete dầu hỏa, axeton, cồn 960).
Các dung môi được khảo sát có nhiệt độ sôi chênh lệch khác nhau, theo tài liệu [15],[16] và dựa vào tính chất của một số phytolcid có trong dịch chiết nên tôi chọn chế độ khảo sát ở điều kiện nhiệt độ 200C.
Hình 3.2. Sơ đồ ngâm chiết một số phytolcid với các loại dung môi
Thuyết minh
Lần lượt cân 10g mẫu đã được xử lý, giã nát và bổ sung thêm 80g Na2SO4 cho vào 4 bình cầu chứa sẵn 80ml dung môi [12] (được đánh số thứ tự từ 1-4):
Bình 1: chứa ete dầu hỏa Bình 2: chứa n- hexan Bình 3: chứa axeton Bình 4: chứa cồn 960
Tiến hành ngâm 4 mẫu trên ở nhiệt độ 200C trong thời gian 30 ngày. Thu dịch chiết, đo giá trị mật độ quang bằng phương pháp UV- VIS ở bước sóng λmax = 240nm. Xác định được độ hấp phụ.
Để thấy được sự biến thiên giá trị mật độ quang diallyl disulfide thu được ở các loại dung môi khác nhau. Giá trị mật độ quang diallyl disunfide được biểu diễn trên hình 3.3
Củ nén đã xử lí
Ete dầu n- hexan axeton cồn 96
Ngâm chiết t0=200C, τ =30 ngày
Đo quang λmax =240nm
Giá trị mật độ quang thu được 1.2004 1.0573 0.9732 0.8698 0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 1.4000 ete dầu hỏa n-hexan axeton cồn 96 D ung môi G iá t rị m ậ t đ ộ q u a n g t h u đ ư ợ c c ủ a d ia ll y l d is u lf id e
Giá trị mật độ quang thu được
Hình 3.3. So sánh hiệu quả chiết diallyl disulfide từ củ nén ở Quảng Nam bằng dung môi hữu cơ khác nhau trong cùng điều kiện
Nhận xét:
Từ hình 3.3, cho thấy : Khi chiết với các loại dung môi khác nhau thì hàm lượng diallyl disulfide thu được cũng hoàn toàn khác nhau. Khi sử dụng dung môi là ete dầu hỏa, n- hexan, axeton, cồn 960 cho giá trị mật độ quang thu được lần lượt là: 1,2004; 1,0573; 0,9732; 0,8698..
Cụ thể khi chiết với axeton giá trị mật độ quang thu được gấp 1.12 lần so với chiết với cồn 960C, chiết bằng ete dầu hỏa cho giá trị mật độ quang cao nhất và gấp 1,38 lần so với khi dùng dung môi là cồn 960C. Từ kết quả thu được, hiệu suất chiết tách diallyl disulfide bằng dung môi được sắp xếp theo thứ tự giảm dần, có nghĩa là ete dầu hỏa > n- hexan > axeton > cồn 960C.
Kết quả thực nghiệm trên hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu được công bố. Theo đề cương nghiên cứu tinh dầu tỏi ở Lý Sơn [10] khi phân tách xác định thành phần của tinh dầu tỏi bằng hai dung môi ete dầu hỏa và cồn 960. Trong đó đáng lưu ý là dung môi ethanol (cồn 960) bởi ethanol cho dù hiệu suất chiết diallyl disulfide thấp hơn ether dầu hỏa song ethanol là dung môi không độc dễ tách khỏi dịch chiết bằng nhiệt.
Sự khác nhau về hiệu quả chiết của dung môi có thể được giải thích như sau: Hiệu quả chiết của dung môi phụ thuộc vào khả năng khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu. Khả năng khuếch tán của dung môi lại phụ thuộc vào bản chất của dung môi (độ nhớt, sức căng bề mặt và khả năng liên kết phân tử của dung môi). Khả năng hòa tan của chất chiết tỉ lệ nghịch với độ nhớt của dung môi, khi độ nhớt của dung môi càng lớn thì lực nội ma sát cản trở chuyển động của các lớp chất lỏng trượt lên nhau càng lớn, dẫn đến khả năng khuếch tán của dung môi giảm.
Các loại dung môi khảo sát có độ nhớt (ở 200C) lần lượt là: μ ete dầu hỏa = 0,30 (cP), μ n-hexan = 0,31 (cP), μ axeton = 0,39 (cP), μ cồn 96 = 1,2 (cP) [1]. Như vậy ete dầu hỏa là dung môi có độ nhớt nhỏ nhất, có nghĩa là lực nội ma sát giữa các phân tử dung môi này nhỏ nên khả năng khuếch tán của ete dầu hỏa vào bên trong nguyên liệu cao hơn axeton, cồn 960, và etanol. Độ nhớt của axeton nhỏ hơn nhiều so với cồn nên hiệu quả chiết tách cũng cao hơn cồn. Sức căng bề mặt và khả năng liên kết phân tử của dung môi lớn sẽ cản trở dung môi thẩm thấu vào bên trong nguyên liệu, do đó làm chậm quá trình lôi kéo các cấu tử cần chiết ra ngoài. Các loại dung môi khảo sát có sức căng bề mặt lần lượt là: ete dầu hỏa = 17,4 (dyn/cm), n-hexan = 17,5 (dyn/cm), axeton = 22 (dyn/cm), cồn = 22,3 (dyn/cm) [2]. Sức căng bề mặt của axeton và cồn 960 cao hơn ete dầu hỏa nên hiệu quả chiết tách của chúng thấp hơn của ete dầu hỏa. Ete dầu hỏa và n-hexan có độ nhớt, sức căng bề mặt và khả năng liên kết phân tử xấp xỉ nhau nên hiệu quả chiết tách cũng tương đương nhau.
Trong quá trình chiết tách, tùy thuộc vào loại dung môi mà hiệu quả chiết tách sẽ khác nhau. Cả 4 loại dung môi được nghiên cứu đều có khả năng chiết được diallyl disulfide, nhưng mỗi loại dung môi lại có những ưu nhược điểm riêng. Các dung môi nghiên cứu đều có nhiệt độ bay hơi thấp nên tiết kiệm được năng lượng trong công đoạn cô đặc thu sản phẩm sau này. Tuy
nhiên, vì khả năng thẩm thấu tốt của chúng nên khi chiết ngoài cấu tử cần chiết còn có rất nhiều cấu tử không mong muốn và các tạp chất đi vào dịch chiết gây nhiều khó khăn cho công đoạn tinh chế. Dung môi ete dầu hỏa và n- hexan đều cho khả năng chiết như nhau và cho giá trị mật độ quang cao nhất (ether dầu hỏa: 1,2004; n-hexan: 1,0573) nhưng đề tài tiến hành chiết một số phytolcid chủ yếu trong dịch chiết củ nén mà trong dịch chiết ngoài diallyl disulfide là một phytolcid có hoạt tính kháng khuẩn cao thì còn có allicin là một chất có khả năng kháng khuẩn mạnh không kém thường có hàm lượng cao [20] trong củ nén được giã nát. Mặc khác, về mặt tính chất hóa học allicin lại là chất tan tốt trong etanol 95% và ete dầu. [39].
Dựa vào tính chất của hai hợp chất có tính kháng khuẩn cao là allicin và diallyl disulfide nên có thể dùng dung môi cồn 960 hoặc ete dầu để ngâm chiết nhưng nén chủ yếu dùng làm gia vị trong chế biến thực phẩm nên sử dụng ethanol 960 là phù hợp. Hơn nữa, ete dầu hỏa có tính độc, chi phí lại cao nên cho dù hiệu suất chiết tách cao hơn so với ethanol. Theo chuyên đề thực phẩm chức năng, khoa nông nghiêp và sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ do PGS-TS Hà Thanh Toàn và các cộng sự [16] việc ngâm tỏi trong rượu cho kết quả khả quan về công dụng phòng ngừa bệnh. Với củ nén, kết quả cũng được chứng minh tương tự. Từ những lý do nêu trên tôi chọn dung môi cồn 960 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách một số phytolcid chủ yếu từ củ nén phytolcid chủ yếu từ củ nén
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tươi (ml/g) đến hiệu suất chiết tách
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết diallyl disulfide. Về mặt lý thuyết khi tỉ lệ này càng lớn thì hiệu quả chiết tách càng cao. Tuy nhiên trong thực tế, tùy theo đặc điểm của mỗi loại nguyên liệu
rất cần xác định tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi cụ thể để vừa đạt hiệu suất chiết tách cao, vừa tiết kiệm dung môi. Hơn nữa nếu dùng tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu tươi quá lớn cũng gây khó khăn cho công đoạn tinh chế sản phẩm