Vật liệu thử nghiệm: Thạch TSA .
Nồng độ thử nghiệm: pha loãng mẫu thử (10-1, 10-2, 10-3,10-4
, 10-5, 10-5) Chủng vi khuẩn thử nghiệm:
Escherichia coli ATCC 25922.
Staphylococcus aureus ATCC 25923. Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145. Bacillus subtilis ATCC 6633.
Thời gian nuôi cấy: 24 giờ
Môi trường nuôi cấy: Thạch TSA Kết quả được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả đo dường kính vòng thủy phân
Vi khuẩn thử nghiệm Đường kính vòng thủy phẩn (mm)
Nồng độ (C) C0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Staphylococcus aureus 14 13,5 13 12,5 11 10 Escherichia coli 10 9 8,5 8 7 6,5 Pseudomonas aeruginosa 8 7,5 7 7 6 5 Bacillus subtilis 8 7 6,5 6 6 5
Từ kết quả bảng 3.3. ta thấy với nồng đô ̣ ban đầu và khi pha loãng nồng độ 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5, đường kính vòng thủy phân thay đổi: đối với khuẩn Staphylococcus aureus có đường kính vòng thủy phân cao nhât 14mm. Khi pha loãng nồng độ 10-1 -10-5 đường kính thay đổi từ 13,5mm- 10mm điều này cho thấy dịch chiết từ củ nén có khả năng kháng khuẩn với Staphylococcus aureus. Theo nghiên cứu của Chu Mạnh Thắng và các cộng sự [15] khi ngâm chiết tỏi, hành tây trong thời gian 30 ngày khả năng kháng
khuẩn của dịch chiết tỏi đối với Staphylococcus aureus có đường kính vòng thủy phân là 17mm, của hành tây 13,4mm. So với dịch chiết tỏi, hành tây khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ nén đối với Staphylococcus aureus là thấp hơn.
Đối với Escherichia coli với nồng đô ̣ ban đầu và khi pha loãng nồng độ từ 10-1 – 10-5 đường kính vòng thủy phân thay đổi 10mm – 6,5mm. Có thể thấy với nồng độ pha loãng đó dịch chiết củ nén ức chế được sự phát triển của khuẩn Escherichia coli so với dịch chiết củ tỏi trong dung môi cồn 960 đường kính thủy phân là 19.5mm và dịch chiết hỗn hợp hẹ, tỏi theo tỉ lệ hẹ: tỏi = 3:7 đường kính vòng thủy phân là 23mm[6] khả năng kháng khuẩn trong dịch chiết củ nén đối với Escherichia coli thấp hơn.
Đối với các chủng Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis đường kính vòng thủy phân giảm từ 8 xuống 5mm. Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ nén đối với 2 loài vi khuẩn này không cao bằng Escherichia coli và Staphylococcus aureus.
Kết quả thực nghiệm trên so với các loài thuộc họ hành tỏi là phù hợp theo các tài liệu nghiên cứu:
- Theo công bố nghiên cứu từ tài liệu [24], [27] ghi nhận các hợp chất S-Metyl methanenthiosulfinate và S-metyl-2-propene-1-thiosulfinate, trích từ hẹ có khả năng diệt được E. Coli O-157 : H7 là vi khuẩn gây hư hại thực phẩm. Thí nghiệm trong ống nghiệm, tác dụng diệt khuẩn của hợp chất allicin có trong tỏi rất mạnh dung dịch 1/85000- 1/125000 đủ ức chế sinh trưởng các trùng Staphylococcus, Streptococus, trùng thương hàn, phó thương hàn, trực trùng lỵ.[9]
- Tương tự, theo nghiên cứu đã công bố trên tạp chí [29] nghiên cứu dịch chiết trong củ hành tây kết quả thu được dịch chiết hoặc nước ép của củ
hành tây ức chế được sự tăng trưởng của Escherichia coli,
Serratiamarcescens, loài Streptococcus, Lactobacillus odontolyticus,
Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhosa. Chiết xuất trong dung môi
ete dầu hỏa của củ hành tây ức chế sự tăng trưởng của Clostridium paraputrificum và Staphylococcus aureus. Tinh dầu có hoạt động chống lại một loạt các loại nấm : Aspergillus niger, Cladosporium werneckii,Candida albicans, Fuarium oxysporium, Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum
candidum, Brettanomyces anomalus và Candida lipolytica.
- Cũng trên tạp chí này khi nghiên cứu về củ tỏi- Bulbus Allii Sativi có một loạt các hoạt tính kháng khuẩn và chống nấm.Kết quả là khi chiết xuất bằng dung môi ethanol và nước cốt của củ tỏi ức chế trong ống nghiệm sự tăng trưởng của các loài Bacillus, Staphylococcus aureus, Shigellasonnei,
Erwinia carotovora, Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli,
Pasteurella multocida, Proteus. [29]
- Theo Robert Duka, Dorina Ardelean nghiên cứu về phytolcid có trong củ tỏi kết quả cho thấy allicin trong củ tỏi và dihydroallinine trong hành tây ức chế được các vi khuẩn có trong tỏi đã chứng minh được khả năng kháng được các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin, Pseudomonasaeruginosa, Esterechia coli và vi khuẩn Bacillus subtilis. [25]
Có thể giải thích như sau do trong thành phần của dịch chiết củ nén có chứa đồng thời hai loại hợp chất có tính kháng khuẩn rất mạnh đó là allicin và dialyl disulfide riêng allicin khi pha loãng nồng độ 1/125000 đã thể hiện khá rõ ràng khả năng ức chế các vi khuẩn (Bacilus subtilis, proteas morgani, salmonella enteritidis, S. Paradysenteriae, Staph. Aureus, Streptococus
viridans, vibrio cholerae) [21], [31]. Thêm vào đó hợp chất diallyl disunfide
dịch chiết từ củ nén trong dung môi cồn 960 có khả năng kháng lại một số chủng vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm từ đây có thể giải thích được vì sao khi sử dụng các cây thuộc họ hành tỏi làm gia vị thì có khả năng ngăn chặn được sự hoạt động của vi khuẩn trong một thời gian nhất định đồng thời tạo hương vị hấp dẫn cho sản phẩm sử dụng chúng.
Từ những kết quả nghiên cứu trên và một số nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các hợp hợp chất phytolcid có trong họ hành tỏi. Có thể nói kết quả thực nghiệm về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ nén ở bảng 3.3 trên là là khá đồng nhất nên có thể xếp nén vào họ hành, tỏi trên phương diện hoạt chất sinh học kháng khuẩn.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
* KẾT LUẬN
1. Xác định được một số thành phần hóa học của củ nén ở Quảng Nam: Nước: 86,3% Glucid tổng: 6,53% Canxi : 0,04% Magiê : 0,03% Kali : 0,25% Natri: 0,02%
Từ thành phần trên cho thấy củ nén hoàn toàn có thể xếp vào họ hành tỏi 2. Trong 4 loại dung môi thực nghiệm, hiệu quả ngâm chiết của ether dầu, n- hexan; axeton; cồn 960 .Trong thí nghiệm chọn cồn 960
3. Đã xác định được các điều kiện ngâm chiết Nhiệt độ: 200C
Thời gian: 30 ngày
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 80/10, ml/g. pH: 7
Từ đó đã đề xuất qui trình ngâm chiết một số phytolcid từ củ nén
4. Bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ đã xác định định danh được một số phytolcid có trong dịch chiết từ củ nén: Allicin, diallyl disulfide
5. Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ nén đối với các vi sinh vật kiểm định tương ứng với đường kính vòng thủy phân cho từng chủng.
* KIẾN NGHỊ
Kháng sinh thực vật là những hợp chất được chiết chủ yếu từ thực vật có nhiều công dụng đối với người và động vật nên để đảm bảo thu hồi được hàm lượng phytolcid từ củ nén cao hơn tinh khiết hơn, có thể ứng dụng nhiều trong
lĩnh vực sức khỏe và y học hơn, tôi xin có một số kiến nghị sau:
1. Dùng phương pháp tách và định lượng allicin, diallyl disulfide.
2. Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu để giữ hoạt tính sinh học của allicin, diallyl disulfide.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
[1] Nguyễn Bin (2001), Các quá trình thiết bị trong công nghệ hóa chất
và thực phẩm, NXB Giáo Dục, Hà Nôi.
[2] Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Bài giảng dược liệu, Tập1, Nhà xuất bản Đại học Dược Hà Nội.
[3] Bộ môn hóa sinh (2003), Sổ tay Thí nghiệm hóa sinh, Trường đại học bách khoa, TPHCM, tr. 1 – 5.
[4] Bộ môn máy thiết bị (1992), Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa
chất, Tập 1, 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
[5] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản giáo dục.
[6] Lê Thị Thu Hiền (2010), Khảo sát tính kháng sinh của chất chiết hành, tỏi, hẹ, lá móng tay trên vi khuẩn E.Coli, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
[7] Trần Việt Hương (2000), Từ điển thảo mộc dược học, Tài liệu y tế, sức khỏe
[8] Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1, Trường đại học Y Dược, Hà Nội, trang 148 – 161.
[9] Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
[10] Lý Kinh Luận (2010), Nghiên cứu trích ly tinh dầu từ tỏi Lý Sơn, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh. [11] Lê Đức Ngoan (2002), Các phương pháp phân tích hóa học cây trồng
[12] A.F. Nametnhicov (1977), Hóa học trong công nghiệp thực phẩm, Bộ môn kỹ thuật đồ hộp và lạnh thực phẩm trường ĐH Bách Khoa dịch, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
[13] Hồ Viết Quý (1999), Các phương pháp phân tích quang học trong hóa học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội.
[14] Hồ Viết Quý (1996), Chiết tách phân chia các chất bằng dung môi hữu
cơ (Lý thuyết – Thực hành - Ứng dụng), Tập 2, Nhà xuất bản khoa
học kỹ thuật.
[15] Chu Mạnh Thắng, Lê Thị Hồng Thảo, Đỗ viết Minh, Nguyễn Thành Long (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp chế biến, bảo quản dịch chiết, bột khô, dung dịch đến hàm lượng kháng sinh
khả năng kháng khuẩn của tỏi, hành tây, Bộ môn dinh dưỡng thức ăn
chăn nuôi.
[16] Hà Thanh Toàn, Lê Nguyễn Kim Nguyên, Trần Thanh Hiền (2010),
Chuyên đề thực phẩm chức năng rượu tỏi, Đại học Cần Thơ khoa
nông nghiệp và sinh học ứng dụng.
[17] Hà Duy Tư (chủ biên, 1996), Quản lý và kiểm tra chất lượng thực phẩm, Đại học bách khoa Hà Nội, tr. 232-233, 303-305.
[18] Viện dược liệu (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
TIẾNG ANH
[19] Arunkumar A, Vijayababu MR, Kanagaraj P, Balasubramanian K, Aruldhas MM, Arunakaran J(2002), Growth suppressing effect of garlic compound diallyl disulfide on prostate cancer cell line (PC-3)
in vitro, Department of Endocrinology, Dr. ALM PG Institute of
[20] P.Bocchini, C.Andalo, R.Pozzi, G.C.Galletti, A.Antonelli (2001),
Determination of dially thiosulfinate (allicin) in Garlic (allium sativum L.) by high-performance liquid chromatography with a post-
column photochemical reactor, “The Analytica Chimina Acta”, 441,
pp.37-43.
[21] Claser and Drobnik (1939), Cavallite and Balley (1944), Hughes and Lawson (1991), Deshpande (1993), Antibacterial Effects of Garlic [22] Robert, Véronique, Mouillé, Béatrice, Mayeur, Camille, (2001), “Effects
of the garlic compound diallyl disulfide on the metabolism, adherence and cell cycle of HT-29 colon carcinoma cells”, Evidence of sensitive
and resistant sub-populations, Oford university press
[23] Eric Block, Sriram Naganathan, David Putman, Shu Hai Zhao (2003), “Allium chemistry: HPLC analysis of thiosulfinates from onion, garlic, wild garlic (ramsoms), leek, scallion, shallot, elephant (great- headed) garlic, chive, and Chinese chive. Uniquely high allyl to methyl ratios in some garlic samples”, Departerment of chemistry, state University of New York at Albany.
[24] Kambiz Baghalian, Seyed Ali Ziai, Mohammad Reza Naghavi, Hassanli Naghli Badi, Ahmad Khalighi (2005), Evaluation of allicin content and botanical in Iranian garlic (Allium sativum L.) ecotypes, The Cientia Horticulturae, 103, pp.155-166
[25] Robert Duka, Dorina Ardelean (2010), Phytoncides and Phytoalexins
vegetal antibiotics, Jurnal medical Aradean Vol. XIII,3, Vasile Goldis
University Press pp 19-25
[26] Sumi (1987),Staba (2001), A commentary on the effect of garlic
extraction and formulation on product composition, Journal of
[27] H.D. Rabinowitch and L. Currah (1991), Allium Crop Science : recent
advances, CABI Publishing
[28] Xiaonan Lu, Barbara A. Rasco, Jamie M. F. Jabal, D. Eric Aston, Mengshi Lin, and Michael E. Konkel (2011), Investigating
Antibacterial Effects of Garlic (Allium sativum) Concentrate and
Garlic-Derived Organosulfur Compounds on Campylobacter
jejuni by Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Raman
Spectroscopy, and Electron Microscopy, Appl Environ Microbiol.
[29] World Health Organization (1999), Who Monographs on selected
Medicinal Plants- Volume 1
CÁC TRANG WEB [30] http://diendankienthuc.net/diendan/showthread.php?p=32046 (ngày 27/3/2012) [31] http://www.duoclieu.org/2012/02/mot-so-duoc-lieu-khang-khuan-voi- cac.html (ngày 2/4/2012) [32] http://www.monanbaithuoc.com (ngày12/12/2012) [33] http://www.nist.gov/index.html (ngày 12/12/2012) [34] http://www.nguyenkynam.com/capnhat/tap11/congdungtoita.htm [35] http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/voha/vh062.htm (ngày 10/5/2012) [36] http://www.vnmilitaryhistory.net (ngày 8/2/2012) [37] http://kids.vuongquocnhi.vn/n/1/76/1807/hanh-tam--vi-thuoc-than (ngày 10/5/2012) [38] http://www.wattpad.com/1394794-duoc-ly-de-cuong-duoc- lieu?p=21#!p=1 (ngày 12/12/2012) [39] http://en.wikipedia.org/wiki/Allicin (ngày 25/11/2012) [40] http://en.wikipedia.org/wiki/Diallyl_disulfide (ngày 25/11/2012) [41] http://vi.wikipedia.org/wiki/Hanh_tam (ngày 25/11/2012)
PHỤ LỤC 1
KẾT QUẢ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỦ NÉN 1.1. Kết quả xác định độ ẩm của củ nén:
Bảng 1.1. Độ ẩm của củ nén
Thí nghiệm Khối lượng cốc sấy (m1), g
Khối lượng mẫu trước khi sấy
(m2), g
Khối lượng mẫu và cốc sau khi sấy (m3),g
Độ ẩm (%)
1 17 20 19,94 85,3
2 17 20 19,7 86,5
3 17 20 19,58 87,1
Vậy độ ẩm trung bình của củ nén là: 86,3%
1.2. Kết quả xác định hàm lượng glucid tổng của củ nén:
Bảng 1.2. Hàm lượng glucid tổng của củ nén
Thí nghiệm Khối lượng mẫu g Thể tích mẫu, ml Thể tích chuẩn, ml Hàm lượng glucid tổng, % 1 10,05 3,2 2,1 6,53 2 3,2 2,2 6,84 3 3,3 2,1 6,33
Vậy hàm lượng glucid tổng trung bình trong củ nén là 6,53%
PHỤ LỤC 2 1.1 Xác định độ ẩm
Tiến hành
Tiến hành cân 3 cốc sấy khô ở nhiệt độ 100- 1500C đến khối lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm.
Cân chính xác 3 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng cho vào 3 cốc sấy.
Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60 -800C trong vào 3 giờ. Sau đó nâng nhiệt độ lên 100- 1500C, sấy khô liên tục trong 8h. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, đem cân ghi kết quả lần 1. Cho lại tủ sấy 100-1500C trong 30 phút, lặp lại như trên đến khối lượng không đổi.
Cách tính độ ẩm: - Độ ẩm mỗi mẫu 100% m m ) m (m W% 2 3 2 1 - Độ ẩm trung bình 3 W(%) (%) W 3 1 TB Trong đó:
m1 : Khối lượng cốc sấy (g)
m2 : Khối lượng nén trước khi sấy (g)
m3 : Khối lượng chén sứ và mẫu nén khô sau khi sấy (g) W (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu.
WTB (%) : Độ ẩm trung bình.
1.2. Xác định hàm lượng glucid tổng trong củ nén
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu: Cân và cho vào cối sứ 10g nguyên liệu tươi, sau đó nghiền nhỏ và trích ly đường nhiều lần bằng nước cất nóng 70-800C. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100ml.
Kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat 10% hay triclo axetic 5%. Nếu dùng chì axetat thì tránh dùng quá dư(2-5ml), sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch bão hòa Na2HPO4 (3-5ml) thêm với lượng vừa đủ để kết tủa hoàn toàn chì axetat dư.
Để yên hỗn hợp trong 10 phút, kiểm tra lại dung dịch xem còn chì axetat dư hay không. Nếu không thì thêm nước cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nước qua lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm xác định đường khử.
Để xác định glucid tổng, lấy vào bình định mức 100ml chính xác 50ml dung dịch xác định đường khử. Thêm 20ml dung dịch HCl 5%, đun cách thủy hỗn hợp trong 30-45 phút.
Làm nguội nhanh, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 2,5N với chỉ thị phenolphtalein (không màu- hồng) hay với chỉ thị methyl đỏ (đỏ - vàng). Định mức tới vạch bằng nước cất.
Chuẩn độ: Cho vào bình nón 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2,5 ml dung dịch NaOH 2,5N. Them vào một giọt methylenblue. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường tổng từ buret, cho từng giọt một, lắc mạnh. Dung dịch sẽ chuyển từ đỏ sang vàng và giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh methylen cho biết phản ứng đã kết thúc.
Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chí có ý nghĩa tham khảo, tiến hành chuẩn độ lần thứ hai. Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferry cyanute, xả nhanh lượng đường (theo kết quả chuẩn độ lần trước), chỉ để lại khoản dưới 1ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối. Tiến hành định mức lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là glucose 0,5%. Tiến hành định mức lặp lại 3 lần.
Tính kết quả
Lượng glucid tổng (Xt) được tính theo công thức: Xt = 0,5* * 1* 2*100 100* *50 g t m V V V V Trong đó: Xt: Lượng đường tổng (%)
Vg: Thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ (ml) Vt: Thể tích dung dịch glucid tổng cho chuẩn độ (ml)
V1: Thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường khử V2: Thể tích bình định mức của dung dịch xác định glucid tổng m: Lượng mẫu cần thí nghiệm (g)