5. Cấu trúc luận văn
1.2.3.Một số dẫn xuất của 1,2,3-triazole trong dƣợc phẩm
1.2.3.1. Tazobactam
- CTPT: C10H12N4O5S
- Danh pháp: (2S,3S,5R)-3-methyl-7-oxo-3-(1H-1,2,3-triazol-1-ylmethyl)-4- thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid 4,4-dioxide
- Công dụng: ức chế hoạt động của các vi khuẩn β-lactamase.
Hình 1.19. Tazobactam Hình 1.20. Thuốc Tazopelin
1.2.3.2. Rufinamide
- CTPT: C10H8F2N4O
- Danh pháp: 1-(2,6-difluorobenzyl)-1H-1,2,3-triazole-4-carboxamide
- Công dụng: thuốc chống co giật. Nó đƣợc sử dụng kết hợp với các loại thuốc và liệu pháp khác để điều trị hội chứng Lennox – Gastaut và các rối loạn co giật khác.
CHƢƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1.1. Dụng cụ
- Ống phản ứng, cột sắc ký.
- Bình cầu 20ml, bình cầu 10ml, phễu lọc, ống nghiệm. - Các pipet loại 5ml, 2ml và 1ml. - Nhiệt kế, giấy lọc. - Bình tam giác 100ml, 250ml. - Cốc thủy tinh 100ml, 500ml. - Một số dụng cụ thủy tinh khác. 2.1.2. Thiết bị
- Tủ hút, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không. - Máy ghi phổ hồng ngoại, máy ghi phổ khối.
- Máy ghi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. - Cân phân tích. - Đèn tử ngoại bƣớc sóng λ= 254nm. 2.1.3. Hóa chất - 4-nitroaniline - 4-methoxybenzylamine - 4-nitrophenyl azide
- Acetophenone, 2-methylacetophenone, 4-nitroacetophenone - Acid acetic, ethanol, toluene
- 4Å molecular sieves
- Dichloromethane, heptane, ethylacetate - Bản mỏng silicagel 60GF254 độ dày 0,2mm - Silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck.
2.2. QUY TRÌNH PHẢN ỨNG
2.2.1. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole
Lần lƣợt cho vào ống phản ứng 207mg (1.26mmol) 4-nitroacetophenone, 240mg (1.74mmol) 4-methoxybenzylamine, 204mg (1.26mmol) 4-nitrophenyl azide, 100mg 4Å molecular sieves, 1- 2 giọt xúc tác CH3COOH và 1.2mL dung môi toluen. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy từ ở 1000C trong thời gian 12 giờ. Quá trình phản ứng đƣợc theo dõi dựa vào sắc kí bản mỏng trong hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột. Ban đầu sử dụng pha động là dung môi CH2Cl2, sau đó cột tiếp tục đƣợc rửa giải bởi hệ dung môiheptan/EtOAc tỉ lệ 6/4. Cuối cùng dung môi đƣợc loại bỏ bởi cất quay dƣới áp suất thấp để thu đƣợc sản phẩm tinh khiết [23].
Sản phẩm đƣợc xác định cấu trúc bởi các phƣơng pháp phổ hiện đại: IR, MS,
1
H-NMR, 13C- NMR.
4-nitroacetophenone, 4-methoxybenzylamine,
4-nitrophenyl azide, Acid acetic, Toluene, 4Å MS.
Khuấy, gia nhiệt ở 1000C trong 12h Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chạy sắc ký cột
Cô quay chân không
2.2.2. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole
Lần lƣợt cho vào ống phản ứng 150mg (1.26mmol) acetophenone, 240mg (1.74mmol) 4-methoxybenzylamine, 204mg (1.26mmol) 4-nitrophenyl azide, 100mg 4Å molecular sieves, 1- 2 giọt xúc tác CH3COOH và 1.2mL dung môi toluen. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy từ ở 1000C trong thời gian 12 giờ. Quá trình phản ứng đƣợc theo dõi dựa vào sắc kí bản mỏng trong hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột. Ban đầu sử dụng pha động là dung môi CH2Cl2, sau đó cột tiếp tục đƣợc rửa giải bởi hệ dung môiheptan/EtOAc tỉ lệ 6/4. Cuối cùng dung môi đƣợc loại bỏ bởi cất quay dƣới áp suất thấp để thu đƣợc sản phẩm tinh khiết [23].
Sản phẩm đƣợc xác định cấu trúc bởi các phƣơng pháp phổ hiện đại: IR, MS,
1
H-NMR, 13C- NMR.
Acetophenone, 4-methoxybenzylamine,
4-nitrophenyl azide, Acid acetic, Toluene, 4Å MS.
Khuấy, gia nhiệt ở 1000C trong 12h Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng
Chạy sắc ký cột
Cô quay chân không
2.2.3. Tổng hợp 1-(4-methoxybenzyl)-5-(p-tolyl)-1H-1,2,3-triazole
Lần lƣợt cho vào ống phản ứng 168mg (1.26mmol) 4-methylacetophenone, 240mg (1.74mmol) 4-methoxybenzylamine, 204mg (1.26mmol) 4-nitrophenyl azide, 100mg 4Å molecular sieves, 1- 2 giọt xúc tác CH3COOH và 1.2mL dung môi toluen. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy từ ở 1000C trong thời gian 12 giờ. Quá trình phản ứng đƣợc theo dõi dựa vào sắc kí bản mỏng trong hệ dung môi heptan/ EtOAc tỉ lệ 6/4. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột. Ban đầu sử dụng pha động là dung môi CH2Cl2, sau đó cột tiếp tục đƣợc rửa giải bởi hệ dung môiheptan/EtOAc tỉ lệ 6/4. Cuối cùng dung môi đƣợc loại bỏ bởi cất quay dƣới áp suất thấp để thu đƣợc sản phẩm tinh khiết [23].
Sản phẩm đƣợc xác định cấu trúc bởi các phƣơng pháp phổ hiện đại: IR, MS,
1
H-NMR, 13C- NMR.
4-methylacetophenone, 4-methoxybenzylamine,
4-nitrophenyl azide, Acid acetic, Toluene, 4Å MS.
Khuấy, gia nhiệt ở 1000C trong 12h Kiểm tra SKLM
Kết thúc phản ứng
Chạy sắc ký cột
Cô quay chân không
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
2.3.1.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký đƣợc dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng đƣợc đi xuyên qua một lớp chất hấp phụ trơ nhƣ silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp phụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên trên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhôm. Sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lƣợng [4].
Sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực [33]: - Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dƣợc khoa. - Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn. - Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
- Giám sát các phản ứng hữu cơ. Ƣu điểm của phƣơng pháp: - Thiết bị đơn giản, dễ thực hiện. - Thời gian không kéo dài. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chỉ cần một lƣợng rất ít mẫu để phân tích.
- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối xứng trong cùng điều kiện phân tích.
- Tách tốt nhiều hỗn hợp phức tạp. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp:
- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình sắc ký. - Các vết sắc ký thƣờng bị kéo đuôi.
Hình 2.1. Sắc ký lớp mỏng
2.3.1.2. Kỹ thuật [33], [34]
Về bản chất, đây là hệ sắc ký lỏng – rắn. Giọt dung dịch mẫu nghiên cứu đƣợc nhỏ trên đƣờng xuất phát cách rìa bản mỏng khoảng 1 cm từ dƣới lên, còn rìa bản đƣợc nhúng vào một dung dịch thích hợp và đƣợc đặt trong một lọ có nắp. Dung môi này đóng vai trò nhƣ pha động trong sắc ký hấp phụ lỏng – rắn. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và vận chuyển các cấu tử của hỗn hợp với các vận tốc khác nhau đƣa đến việc tách các cấu tử.
Hình 2.2. Quá trình sắc ký lớp mỏng
Các hợp chất đƣợc tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có đƣợc chỗ liên kết với pha tĩnh. Những chất có sự tƣơng tác yếu với pha tĩnh sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký. Ngƣợc lại, những chất có sự tƣơng tác mạnh với pha tĩnh thì di chuyển một đoạn thấp hơn trên bản sắc ký. Nếu thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngƣợc lại trên bản sắc ký.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực đƣợc dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi đƣợc sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực hoặc phân cực một phần nếu pha tĩnh phân cực, và ngƣợc lại.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, đƣợc tính bằng công thức: Rf =
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm); b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết (cm). Nhƣ vậy, Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi.
Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến Rf nhƣng quan trọng là: + Chất lƣợng và hoạt tính chất hấp thụ.
+ Bề dày của lớp bản mỏng.
+ Chất lƣợng và độ tinh khiết của pha động [35].
Hình 2.3. Hình minh họa a và b trên bản mỏng
2.3.1.3. Quá trình sắc ký lớp mỏng [34]
- Chuẩn bị ống mao quản: ống thủy tinh có đƣờng kính trong nhỏ, khoảng 1 – 2 mm, một đầu đƣợc vót nhọn.
- Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thƣơng mại 20x20 cm, dùng kéo cắt bản mỏng với kích thƣớc cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyết dung môi.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu: chất lỏng có thể đƣợc chấm trực tiếp lên bản mỏng, với dung dịch quá sệt có thể pha loãng mẫu, với chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu cơ thích hợp. Dùng ống mao quản để chấm dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt lớp bản mỏng.
- Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm.
- Giải ly để dung môi di chuyển lên trên: sau khi bình đã bão hòa dung môi, ta đặt tấm bản mỏng vào bình khai triển. Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập trong dung môi giải ly khoảng 0.5 – 1 cm. Các vết mẫu không đƣợc ngập trong dung môi động.
- Hiện hình các vết sau khi giải ly: các hợp chất có màu sẽ đƣợc nhìn thấy bằng mắt thƣờng nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên muốn nhìn thấy các vết ta cần sử dụng các phƣơng pháp vật lí hoặc hóa học. Với phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta phun lên toàn bản mỏng (dƣới dạng phun sƣơng) một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hợp chất màu nhìn rõ bằng mắt thƣờng (nhƣ hơi iot...). Với phƣơng pháp vật lí, ngƣời ta soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại UV và quan sát [11].
Hình 2.4. Các vết trên bản mỏng hiện hình sau khi sử dụng các phương pháp vật lí và hóa học
2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
2.3.2.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký cột
Sắc kí cột là một dạng của sắc kí giấy hoặc sắc kí lớp mỏng nhƣng ở đây pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai dung môi một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột mà sự tách trong cột có thể xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc cơ chế phân bố (cột phân bố) [4].
Cột sắc kí thƣờng là một ống thủy tinh đƣờng kính d = 0.5 ÷ 5 cm và có độ dài l = 20 ÷ 100 cm, đƣợc đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dƣới có gắn một khóa. Pha tĩnh rắn đƣợc nhồi vào cột. Mẫu cần tách đƣợc đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi đƣợc rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống phía dƣới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột và đƣợc hứng trong những ống nghiệm. Tốc độ chuyển động của pha động đƣợc điều khiển nhờ van lắp ở phía dƣới cột [7].
Các cột sắc ký thƣờng đƣợc dùng trong các phòng thí nghiệm hữu cơ để loại bỏ các nguyên liệu ban đầu chƣa phản ứng hết hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2.1. Kỹ thuật
a. Lựa chọn hệ dung môi [7]
Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất. Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bƣớc cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp, gọi là dung dịch mẫu.
- Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với một loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Cho mỗi bản mỏng hiện hình dƣới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm đƣợc hệ dung môi phù hợp để chạy cột sắc kí. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp ba dung môi khác nhau.
Dễ phân tách Khó phân tách
Hình 2.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả phân tách b. Lựa chọn chất hấp phụ [7]
Thông thƣờng ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel hay aluminium oxit.
c. Nhồi cột [7]
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Có hai phƣơng pháp nhồi cột phổ biến: nhồi cột khô và nhồi cột ƣớt.
- Nhồi cột ƣớt: Cố định cột trên giá. Cho hệ dung môi chạy cột vào cốc. Cho đều đặn lƣợng silicagel cần cho quá trình chạy cột vào cốc đã chứa sẵn dung môi,
mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại lên đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp sệt vào cột cho đến hết số lƣợng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để silicagel nén đều trong cột. Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc chặt chẽ, cho đến khi silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
Lƣu ý:
+ Không nên rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
+ Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
+ Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chƣa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
- Nhồi cột khô: Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Rót dung môi vào khoảng hai phần ba chiều cao cột. Thông qua một phễu lọc có đuôi dài, cho từ từ silicagel dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Sau khi nạp silicagel xong, cho dung môi chảy qua vài lần đến khi thấy silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
d. Đưa chất thử vào cột [4]
Yêu cầu của việc đƣa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có hai cách đƣa chất thử vào cột:
- Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa chất thử với một lƣợng vừa đủ dung môi. Cột đã ổn định mở vòi cho dung môi chảy đến khi mặt cột hấp phụ vừa khô thì đóng vòi lại. Dùng ống hút lấy dung dịch thử cho đều đặn lên mặt cột (cho vào từ từ theo thành cột). Mở vòi cho dung dịch thử ngấm vào cột. Khi toàn bộ lớp dung dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy dung môi rửa thành cột, và cũng cho