5. Cấu trúc luận văn
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
2.3.1.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký đƣợc dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng đƣợc đi xuyên qua một lớp chất hấp phụ trơ nhƣ silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp phụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên trên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhôm. Sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lƣợng [4].
Sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực [33]: - Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dƣợc khoa. - Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn. - Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
- Giám sát các phản ứng hữu cơ. Ƣu điểm của phƣơng pháp: - Thiết bị đơn giản, dễ thực hiện. - Thời gian không kéo dài.
- Chỉ cần một lƣợng rất ít mẫu để phân tích.
- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối xứng trong cùng điều kiện phân tích.
- Tách tốt nhiều hỗn hợp phức tạp. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp:
- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình sắc ký. - Các vết sắc ký thƣờng bị kéo đuôi.
Hình 2.1. Sắc ký lớp mỏng
2.3.1.2. Kỹ thuật [33], [34]
Về bản chất, đây là hệ sắc ký lỏng – rắn. Giọt dung dịch mẫu nghiên cứu đƣợc nhỏ trên đƣờng xuất phát cách rìa bản mỏng khoảng 1 cm từ dƣới lên, còn rìa bản đƣợc nhúng vào một dung dịch thích hợp và đƣợc đặt trong một lọ có nắp. Dung môi này đóng vai trò nhƣ pha động trong sắc ký hấp phụ lỏng – rắn. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động dọc theo lớp hấp phụ và vận chuyển các cấu tử của hỗn hợp với các vận tốc khác nhau đƣa đến việc tách các cấu tử.
Hình 2.2. Quá trình sắc ký lớp mỏng
Các hợp chất đƣợc tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có đƣợc chỗ liên kết với pha tĩnh. Những chất có sự tƣơng tác yếu với pha tĩnh sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký. Ngƣợc lại, những chất có sự tƣơng tác mạnh với pha tĩnh thì di chuyển một đoạn thấp hơn trên bản sắc ký. Nếu thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngƣợc lại trên bản sắc ký.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực đƣợc dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi đƣợc sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực hoặc phân cực một phần nếu pha tĩnh phân cực, và ngƣợc lại.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, đƣợc tính bằng công thức: Rf =
Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm); b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đƣờng đi của vết (cm). Nhƣ vậy, Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi.
Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến Rf nhƣng quan trọng là: + Chất lƣợng và hoạt tính chất hấp thụ.
+ Bề dày của lớp bản mỏng.
+ Chất lƣợng và độ tinh khiết của pha động [35].
Hình 2.3. Hình minh họa a và b trên bản mỏng
2.3.1.3. Quá trình sắc ký lớp mỏng [34]
- Chuẩn bị ống mao quản: ống thủy tinh có đƣờng kính trong nhỏ, khoảng 1 – 2 mm, một đầu đƣợc vót nhọn.
- Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thƣơng mại 20x20 cm, dùng kéo cắt bản mỏng với kích thƣớc cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyết dung môi.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu: chất lỏng có thể đƣợc chấm trực tiếp lên bản mỏng, với dung dịch quá sệt có thể pha loãng mẫu, với chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu cơ thích hợp. Dùng ống mao quản để chấm dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt lớp bản mỏng.
- Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm.
- Giải ly để dung môi di chuyển lên trên: sau khi bình đã bão hòa dung môi, ta đặt tấm bản mỏng vào bình khai triển. Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập trong dung môi giải ly khoảng 0.5 – 1 cm. Các vết mẫu không đƣợc ngập trong dung môi động.
- Hiện hình các vết sau khi giải ly: các hợp chất có màu sẽ đƣợc nhìn thấy bằng mắt thƣờng nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên muốn nhìn thấy các vết ta cần sử dụng các phƣơng pháp vật lí hoặc hóa học. Với phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta phun lên toàn bản mỏng (dƣới dạng phun sƣơng) một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hợp chất màu nhìn rõ bằng mắt thƣờng (nhƣ hơi iot...). Với phƣơng pháp vật lí, ngƣời ta soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại UV và quan sát [11].
Hình 2.4. Các vết trên bản mỏng hiện hình sau khi sử dụng các phương pháp vật lí và hóa học
2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
2.3.2.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký cột
Sắc kí cột là một dạng của sắc kí giấy hoặc sắc kí lớp mỏng nhƣng ở đây pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai dung môi một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột mà sự tách trong cột có thể xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc cơ chế phân bố (cột phân bố) [4].
Cột sắc kí thƣờng là một ống thủy tinh đƣờng kính d = 0.5 ÷ 5 cm và có độ dài l = 20 ÷ 100 cm, đƣợc đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dƣới có gắn một khóa. Pha tĩnh rắn đƣợc nhồi vào cột. Mẫu cần tách đƣợc đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi đƣợc rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống phía dƣới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột và đƣợc hứng trong những ống nghiệm. Tốc độ chuyển động của pha động đƣợc điều khiển nhờ van lắp ở phía dƣới cột [7].
Các cột sắc ký thƣờng đƣợc dùng trong các phòng thí nghiệm hữu cơ để loại bỏ các nguyên liệu ban đầu chƣa phản ứng hết hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành.
2.3.2.1. Kỹ thuật
a. Lựa chọn hệ dung môi [7]
Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất. Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bƣớc cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp, gọi là dung dịch mẫu.
- Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với một loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Cho mỗi bản mỏng hiện hình dƣới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm đƣợc hệ dung môi phù hợp để chạy cột sắc kí. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp ba dung môi khác nhau.
Dễ phân tách Khó phân tách
Hình 2.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả phân tách b. Lựa chọn chất hấp phụ [7]
Thông thƣờng ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel hay aluminium oxit.
c. Nhồi cột [7]
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Có hai phƣơng pháp nhồi cột phổ biến: nhồi cột khô và nhồi cột ƣớt.
- Nhồi cột ƣớt: Cố định cột trên giá. Cho hệ dung môi chạy cột vào cốc. Cho đều đặn lƣợng silicagel cần cho quá trình chạy cột vào cốc đã chứa sẵn dung môi,
mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại lên đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp sệt vào cột cho đến hết số lƣợng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để silicagel nén đều trong cột. Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc chặt chẽ, cho đến khi silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
Lƣu ý:
+ Không nên rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
+ Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
+ Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chƣa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
- Nhồi cột khô: Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Rót dung môi vào khoảng hai phần ba chiều cao cột. Thông qua một phễu lọc có đuôi dài, cho từ từ silicagel dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Sau khi nạp silicagel xong, cho dung môi chảy qua vài lần đến khi thấy silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
d. Đưa chất thử vào cột [4]
Yêu cầu của việc đƣa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có hai cách đƣa chất thử vào cột:
- Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa chất thử với một lƣợng vừa đủ dung môi. Cột đã ổn định mở vòi cho dung môi chảy đến khi mặt cột hấp phụ vừa khô thì đóng vòi lại. Dùng ống hút lấy dung dịch thử cho đều đặn lên mặt cột (cho vào từ từ theo thành cột). Mở vòi cho dung dịch thử ngấm vào cột. Khi toàn bộ lớp dung dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy dung môi rửa thành cột, và cũng cho ngấm hết vào cột. Tiếp đến là giai đoạn cho dung môi vào cột, phải chú ý thật nhẹ
nhàng, không để mặt cột bị xáo trộn mạnh. Có thể dùng một lớp silicagel phủ lên mặt cột sau khi đã vào xong chất thử.
- Trộn một lƣợng bột chất hấp phụ với chất thử: Hoà tan hoàn toàn chất thử trong dung môi thích hợp, cho một lƣợng silicagel vừa đủ vào (lƣợng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhƣng phải đủ để có thể cô quay mẫu đƣợc khô hoàn toàn) rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy chất thử đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel đƣợc điều chỉnh lƣợng dung môi vừa đủ (đủ thấm ƣớt mẫu khô cho vào). Cho chất thử vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã đƣợc gắn đều chất thử thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.
2.3.3. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại
2.3.3.1. Tổng quan về phổ hồng ngoại
Hầu hết các hợp chất, cả vô cơ lẫn hữu cơ, chứa liên kết cộng hóa trị đều hấp thụ các tần số khác nhau của bức xạ điện từ trong vùng hồng ngoại. Trong nghiên cứu hóa học, các nhà khoa học quan tâm đến vùng hồng ngoại từ 2.5 µm đến 25 µm liên quan đến dao động của các liên kết cộng hóa trị [5], [6].
Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR) là phƣơng pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại khi nó đi qua một lớp chất cần thử, ở các số sóng khác nhau. Trong phân tử, khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lƣợng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trƣng. Đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR [1].
Trên phổ IR, trục tung là phần trăm độ truyền quang (T%). Độ truyền quang 100% nghĩa là mẫu thử không hấp thụ bức xạ, còn độ truyền quang 0% tức toàn bộ bức xạ đã bị hấp thụ. Trục hoành trong phổ hồng ngoại là khoảng số sóng từ 4000 cm-1 – 400 cm-1.
Hình 2.7. Các vùng phổ quang học
2.3.3.2. Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại [6], [10]
Mỗi phân tử chỉ hấp thụ những tần số chọn lọc của bức xạ hồng ngoại và sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại tƣơng ứng với hấp thụ năng lƣợng trong khoảng từ 8 đến 40 kJ/mol. Bức xạ trong khoảng này tƣơng ứng với tần số dao động kéo giãn (hay còn gọi là dao động hóa trị) và tần số dao động uốn cong (hay còn gọi là dao động biến dạng) của liên kết cộng hóa trị. Tuy nhiên không phải tất cả các liên kết cộng hóa trị đều có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại, cho dù năng lƣợng của bức xạ hồng ngoại phù hợp với tần số dao động của liên kết. Chỉ có những liên kết có momen lƣỡng cực thay đổi nhƣ một hàm số phụ thuộc vào thời gian mới có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại (tức là liên kết có momen lƣỡng cực khác 0).
2.3.3.3. Phổ dao động quay của phân tử hai nguyên tử [6], [10]
a. Dao động hóa trị và dao động biến dạng
Khi phân tử hấp thụ bức xạ hồng ngoại trong vùng hồng ngoại trung bình sẽ xuất hiện hai dạng dao động của liên kết cộng hóa trị là dao động hóa trị và dao động biến dạng.
- Dao động hóa trị: là dao động làm thay đổi chiều dài liên kết nhƣng không làm thay đổi góc liên kết. Dao động hóa trị bất đối xứng xảy ra ở tần số cao hơn dao động hóa trị đối xứng.
a b
- Dao động biến dạng là dao động làm biến dạng góc liên kết nhƣng không làm thay đổi chiều dài liên kết.
Hình 2.9. Dao động biến dạng trong cùng mặt phẳng
Dao động hóa trị xảy ra ở tần số cao hơn dao động biến dạng.
b. Dao động điều hòa và dao động không điều hòa
- Dao động điều hòa
Phân tử hai nguyên tử đƣợc xem nhƣ hai hòn bi dao động nối với nhau bởi một lò xo. Chiều dài liên kết thay đổi liên tục nhƣng chiều dài liên kết trung bình có thể xác định đƣợc. Khi một trong hai hòn bi bị giữ chặt và hòn bi còn lại nén lại hoặc kéo giãn một đoạn rồi thả tự do thì nó sẽ dao động quanh vị trí cân bằng với biên độ không đổi.
Lực nén hoặc lực kéo giãn tuân theo định luật Hook: F = -k(r – r0)2
Năng lƣợng của dao động điều hòa đƣợc tính theo công thức:
Nhƣ vậy, khi khoảng cách giữa hai nguyên tử tăng lên hoặc giảm xuống so với khoảng cách cân bằng r0 thì năng lƣợng E của dao động đều tăng lên. Năng lƣợng của dao động tỉ lệ thuận với tần số của dao động điều hòa.
√
Trong đó: : tần số do dao động tự nhiên của phân tử. c: tốc độ ánh sáng (c = 3.108 m/s)
k: hằng số lực của liên kết.