5. Cấu trúc luận văn
2.3.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
2.3.2.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký cột
Sắc kí cột là một dạng của sắc kí giấy hoặc sắc kí lớp mỏng nhƣng ở đây pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai dung môi một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột mà sự tách trong cột có thể xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc cơ chế phân bố (cột phân bố) [4].
Cột sắc kí thƣờng là một ống thủy tinh đƣờng kính d = 0.5 ÷ 5 cm và có độ dài l = 20 ÷ 100 cm, đƣợc đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dƣới có gắn một khóa. Pha tĩnh rắn đƣợc nhồi vào cột. Mẫu cần tách đƣợc đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi đƣợc rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống phía dƣới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột và đƣợc hứng trong những ống nghiệm. Tốc độ chuyển động của pha động đƣợc điều khiển nhờ van lắp ở phía dƣới cột [7].
Các cột sắc ký thƣờng đƣợc dùng trong các phòng thí nghiệm hữu cơ để loại bỏ các nguyên liệu ban đầu chƣa phản ứng hết hoặc phân lập một sản phẩm mong muốn khỏi các sản phẩm phụ sau khi phản ứng hoàn thành.
2.3.2.1. Kỹ thuật
a. Lựa chọn hệ dung môi [7]
Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất. Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bƣớc cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lƣợng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích hợp, gọi là dung dịch mẫu.
- Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
- Mỗi bản mỏng đƣợc chạy với một loại dung môi có độ phân cực khác nhau. Cho mỗi bản mỏng hiện hình dƣới đèn UV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy đƣợc dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm đƣợc hệ dung môi phù hợp để chạy cột sắc kí. Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp ba dung môi khác nhau.
Dễ phân tách Khó phân tách
Hình 2.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả phân tách b. Lựa chọn chất hấp phụ [7]
Thông thƣờng ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel hay aluminium oxit.
c. Nhồi cột [7]
Để việc tách chất đƣợc tốt, silicagel phải đƣợc nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thƣờng. Có hai phƣơng pháp nhồi cột phổ biến: nhồi cột khô và nhồi cột ƣớt.
- Nhồi cột ƣớt: Cố định cột trên giá. Cho hệ dung môi chạy cột vào cốc. Cho đều đặn lƣợng silicagel cần cho quá trình chạy cột vào cốc đã chứa sẵn dung môi,
mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá để dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục đƣợc dùng để rót trở lại lên đầu cột). Tiếp tục rót hỗn hợp sệt vào cột cho đến hết số lƣợng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để silicagel nén đều trong cột. Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột đƣợc chặt chẽ, cho đến khi silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
Lƣu ý:
+ Không nên rót dung môi vào silicagel bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không đồng nhất.
+ Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột.
+ Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng silicagel phải phẳng. Nếu mặt thoáng chƣa phẳng ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thoáng bằng phẳng.
- Nhồi cột khô: Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá. Rót dung môi vào khoảng hai phần ba chiều cao cột. Thông qua một phễu lọc có đuôi dài, cho từ từ silicagel dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Sau khi nạp silicagel xong, cho dung môi chảy qua vài lần đến khi thấy silicagel trong cột có dạng đồng nhất.
d. Đưa chất thử vào cột [4]
Yêu cầu của việc đƣa chất thử vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có hai cách đƣa chất thử vào cột:
- Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa chất thử với một lƣợng vừa đủ dung môi. Cột đã ổn định mở vòi cho dung môi chảy đến khi mặt cột hấp phụ vừa khô thì đóng vòi lại. Dùng ống hút lấy dung dịch thử cho đều đặn lên mặt cột (cho vào từ từ theo thành cột). Mở vòi cho dung dịch thử ngấm vào cột. Khi toàn bộ lớp dung dịch thử đã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy dung môi rửa thành cột, và cũng cho ngấm hết vào cột. Tiếp đến là giai đoạn cho dung môi vào cột, phải chú ý thật nhẹ
nhàng, không để mặt cột bị xáo trộn mạnh. Có thể dùng một lớp silicagel phủ lên mặt cột sau khi đã vào xong chất thử.
- Trộn một lƣợng bột chất hấp phụ với chất thử: Hoà tan hoàn toàn chất thử trong dung môi thích hợp, cho một lƣợng silicagel vừa đủ vào (lƣợng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhƣng phải đủ để có thể cô quay mẫu đƣợc khô hoàn toàn) rồi đem cất quay đuổi dung môi đến khô hoàn toàn. Lấy chất thử đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel đƣợc điều chỉnh lƣợng dung môi vừa đủ (đủ thấm ƣớt mẫu khô cho vào). Cho chất thử vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã đƣợc gắn đều chất thử thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vón cục.