5. Cấu trúc luận văn
2.3.4. Phƣơng pháp phổ khối
2.3.4.1. Tổng quan về phổ khối [9]
Phổ khối là một kỹ thuật không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực. Ngành công nghệ sinh học sử dụng phổ khối để phân tích và xác định trình tự của các amino axit trong protein, trình tự của các nucleotide trong oligonucleotide, trình tự các saccharide trong polysaccharide. Công nghệ dƣợc phẩm sử dụng phổ khối trong tất cả các pha của quá trình phát triển thuốc, từ phát hiện hợp chất có hoạt tính và phân tích cấu trúc, đến quá trình tổng hợp, kiểm tra dƣợc động học và chuyển hóa thuốc. Trong các bệnh viện trên khắp thế giới, phổ khối đƣợc sử dụng để kiểm tra máu và nƣớc tiểu nhằm kiểm tra sự có mặt và mức độ của các hợp chất là các tác nhân gây bệnh, phát hiện và định lƣợng các chất cấm và chất kích thích.
Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, trong đó ứng dụng quan trọng nhất là xác định cấu trúc các hợp chất chƣa biết bằng cách dựa vào khối lƣợng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó.
2.3.4.2. Nguyên tắc chung [6]
Khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lƣợng cao, từ các phân tử sẽ bật ra 1 hay 2 electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 và +2. Quá trình biến các phân tử trung hòa thành các ion đƣợc gọi là sự ion hóa.
Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lƣợng lớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành các mảnh ion, gốc hoặc phân tử trung hòa khác nhau. Quá trình này đƣợc gọi là quá trình phân mảnh.
ABC+ A+ + BC ABC+ AB+ + C
Năng lƣợng quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30 – 100 eV, cao hơn năng lƣợng ion hóa phân tử (8 – 15 eV).
Dựa vào sự khác nhau về tỉ số khối lƣợng / điện tích (m/z), các ion sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau và xác định xác suất có mặt của chúng.
2.3.4.3. Cấu tạo của khối phổ kế [6], [10]
Hình 2.10. Sơ đồ thành phần của một phổ kế đo khối lượng
ABC + e
ABC2+ + 3e
Một khối phổ kế có 5 phần chính. Phần đầu tiên là buồng bơm mẫu (có thể gọi là lối vào của mẫu), đây là nơi mẫu đƣợc hóa hơi và đi vào môi trƣờng áp suất thấp của máy đo phổ khối. Áp suất bên trong thiết bị đo phổ khối thay đổi từ vài mmHg trong vùng ion hóa hóa học đến vài µmHg trong vùng phân tích khối lƣợng và vùng detector. Mẫu ở trạng thái hơi đƣợc đƣa vào buồng ion hóa, đây là nơi
mẫu đƣợc ion hóa thành các ion ở pha khí và sau đó, các ion ở pha khí đƣợc tăng tốc trong một trƣờng điện từ. Bộ phận phân tích khối lƣợng sẽ phân tách các ion dựa vào tỉ số khối lƣợng / điện tích (m/z). Các ion sau đó đƣợc đếm bởi detector và tín hiệu đƣợc ghi lại, xử lí bởi hệ thống phân tích dữ liệu. Phổ đồ là đồ thị của số ion đƣợc phát hiện và tỉ số khối lƣợng / điện tích (m/z) của chúng.
2.3.4.4. Các phương pháp ion hóa
a. Ion hóa bằng dòng electron [6]
Trong phổ khối ion hóa bằng dòng electron, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ một sợi dây bóng đèn đƣợc đốt nóng đến vài nghìn độ C. Các electron có năng lƣợng cao này sẽ va đập với dòng phân tử đi vào từ hệ thống bơm mẫu. Sự va chạm sẽ làm bật một electron ra khỏi phân tử để tạo thành cation. Một bản “đẩy” mang điện tích dƣơng sẽ hƣớng các ion vừa đƣợc tạo thành về phía các bản tăng tốc.
Hầu hết những phân tử không đƣợc ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân không và đƣợc kết nối với buồng ion hóa. Một số phân tử chuyển thành ion âm sẽ đƣợc hấp thu bởi bản “đẩy” ion. Một tỉ lệ nhỏ các ion tích điện dƣơng đƣợc hình thành có thể có điện tích lớn hơn 1 (do mất nhiều electron). Những ion có điện tích lớn hơn 1 này sẽ đƣợc tăng tốc theo cách tƣơng tự nhƣ các ion có điện tích +1.
Tóm lại, trong phƣơng pháp ion hóa bằng dòng electron, một lƣợng nhỏ mẫu đƣợc làm bay hơi, sau đó tƣơng tác với dòng electron có năng lƣợng cao để ion hóa mẫu. Các ion sau đó đƣợc phát hiện dựa vào tử số khối lƣợng / điện tích (m/z). Đây là phƣơng pháp đơn giản và phổ biến nhất để chuyển mẫu thành ion.
b. Ion hóa hoá học [6]
Sự ion hóa trong phƣơng pháp đo phổ khối ion hóa hóa học phụ thuộc vào sự va chạm của các ion và phân tử chát cần đo. Mẫu bị ion hóa do sự va chạm với các ion đƣợc tạo ra với lƣợng lớn từ các chất khí hoặc chất lỏng dễ bay hơi. Tác nhân ion hóa phổ biến trong phƣơng pháp này bao gồm: methane, amonia, isobutane và methanol.
Sự thay đổi chất khí phản ứng cho phép ta thay đổi tính chọn lọc của quá trình ion hóa và mức độ phân mảnh. Khi sử dụng chất khí phản ứng có ái lực proton phù hợp với ái lực proton của mẫu thì ta sẽ thu đƣợc nhiều hơn các ion phân tử còn nguyên vẹn và ít hơn các ion mảnh.