2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là thân, lá, rễ và hoa của cây An điền lá thông được thu hái tại Thừa Thiên Huế vào ngày 25 tháng 09 năm 2014. Cây An điền lá thông –
đã được định danh, sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ
dày 0,2mm.
Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck và Sephadex LH – 20.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ khối GC/MS đo trên máy Agilent 7890A/5975C. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR, 13C – NMR, HSQC và HMBC đo trên máy Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội là TMS cho 1H – NMR và tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 13C – NMR.
Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để
soi bản mỏng.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không, máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột sắc ký,…
Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng Vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4đặc, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110oC.
Dung môi dùng để chạy cột và triển khai sắc ký lớp mỏng bao gồm n- hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH và BuOH loại tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm.
Một số hóa chất khác cũng được sử dụng.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm
- Nguyên tắc: sấy mẫu đến khối lượng không đổi, cân phần khối lượng còn lại, ta xác định được độẩm của nguyên liệu.
- Cách tiến hành:
+ Sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không
đổi, dùng cân phân tích để xác định trọng lượng cốc cân mo(g). Bỏ vào cốc khoảng 2g bột mẫu nguyên liệu, đem cân, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu cân là m1(g).
+ Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.
+ Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2(g).
Công thức tính độẩm (W):
W =
x100% Trong đó:
m0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi. m1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy.
m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi. Lấy kết quả trung bình của năm lần thí nghiệm.
2.2.2. Phương pháp xác định làm lượng tro
- Nguyên tắc: đốt cháy và nung mẫu nguyên liệu ở nhiệt độ 6000C đến khối lượng không đổi. Độ chênh lệch khối lượng trước và sau khi đem tro hóa chính là hàm lượng hữu cơ bịđốt cháy, tro còn lại chứa chất vô cơ.
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Đặt chén nung vào lò đã được đốt nóng, giữ trong 60 phút ở nhiệt độ
6000C, sau đó lấy ra và đặt vào bình hút ẩm khi nhiệt độ ở trong bình hút ẩm ngang bằng với nhiệt độ môi trường. Tiến hành cân chén nung với sai số
không vượt quá 0,001g. Khối lượng cốc là mo(g).
+ Cân mẫu nguyên liệu 2g, cho mẫu vào chén nung, sau đó đặt lên bếp
điện và nung nấu ở nhiệt độ 1000C cho đến khi mất nước hoàn toàn. Đặt chén vào lò nung ở nhiệt độ 6000C trong khoảng 60 phút, làm nguội trong bình hút
ẩm ở nhiệt độ môi trường rồi đem cân. Quá trình này lặp đi lặp lại cho đến khi hiệu quả hai lần cân cuối cùng không vượt quá 0,001g. Ghi lại giá trị khối lượng nhỏ nhất. Khối lượng cốc và tro sau khi nung là m2(g).
- Xử lí kết quả: Hàm lượng tro chung (X) tính bằng phần trăm khối lượng của chất khô còn lại so với khối lượng chất khô ban đầu:
X = x 100% Trong đó:
mo là khối lượng cốc (g).
m1 là khối lượng mẫu đem phân tích (g). m2 là khối lượng cốc và tro sau khi nung (g). X là hàm lượng tro (%).
2.2.3. Phương pháp chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật thường được chiết theo phương pháp chiết rắn lỏng. Có nhiều kỹ thuật chiết như: chiết ngấm kiệt, chiết ngâm dầm, chiết Soxhlet, chiết lôi cuốn hơi nước…
Đối với kỹ thuật chiết ngấm kiệt: mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi n-hexane, EtOAc và BuOH. Với mỗi loại dung môi được chiết ba lần. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không sẽ thu được các cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu.
Đối với kĩ thuật chiết ngâm dầm: Ngâm mẫu thực vật (bột cây) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, ảnh hưởng đến kết quả.
Rót dung môi tinh khiết (H2O, MeOH) vào bình cho đến bề mặt của lớp bột cây. Chiết mẫu ở nhiệt độ từ 550C – 600C. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc. Quá trình chiết được lặp lại nhiều lần, mỗi lần chiết khoảng 1h. Gộp dịch chiết, cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không, thu được cao chiết tổng. Có thể gia tăng hiệu quả
chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo lộn, xốc đều hoăc sử dụng máy siêu âm. Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n-hexane và CH2Cl2 bằng phễu chiết. Với mỗi loại dung môi thực hiện chiết 3 lần. Các dịch chiết được cất loại dung môi sẽ thu được các cao chiết tương ứng (cao chiết n-hexane và CH2Cl2) để tiếp tục nghiên cứu.
Trong khuôn khổ đề tài này, tôi thực hiện việc chiết mẫu theo kỹ thuật chiết ngâm dầm.
2.2.4. Phương pháp tách và tinh chế chất
Các cao chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng với các hệ
dung môi thích hợp. Sắc ký cột gồm sắc ký cột thường và sắc ký cột nhanh (flash chromatography) sử dụng silica gel. Đối với các chất có khối lượng phân tử khác nhau có thể sử dụng sắc ký cột Sephadex LH–20. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất cũng như theo dõi quá trình tách chất trên cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ
dung môi thích hợp.
2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Việc định tính và định lượng sơ bộ một số hợp chất có trong các cao chiết
được thực hiện thông qua việc đo phổ GC/MS trên máy Agilent 7890A/5975C tại trung tâm đo lường chất lượng II Đà Nẵng, với điều kiện chạy sắc ký như sau: Chương trình sắc ký Cột sắc ký mao quản: HP-5: 30 m x 250 µm x 0.25 µm - Chương trình nhiệt độ lò cột 50 °C(0’) 120 °C 200 °C 300 °C (10’) Buồng tiêm mẫu - Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 280 °C - Áp suất 10 psi - Tỷ lệ chia dòng 5 :1 - Thể tích tiêm 1µL Khối phổ - Khoảng phổ quét: 28 – 600 m/z - Nhiệt độ nguồn: 230oC - Nhiệt độ bộ tứ cực: 150oC
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, HSQC, HMBC. Các loại phổ được
đo tại Viện Hoá học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
2.3. SƠ ĐỒĐIỀU CHẾ CÁC CAO
Quá trình điều chế các loại cao được mô tả theo hình sau:
Hình 2.1. Sơ đồđiều chế các cao
ØĐiều chế cao tổng
Nguyên liệu là cây An điền lá thông sau khi thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khô, rồi đem xay nhỏ thì được 640g bột.
- Lần 1: Cho 640g bột nguyên liệu vào bình cầu, cho 3 lít dung dịch MeOH/H2O (95:5), ngâm khoảng 12 giờ. Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch chiết.
- Lần 2: Cho 3 lít dung dịch MeOH/H2O (95:5) vào bã nguyên liệu đã chiết lần 1, ngâm khoảng 12 giờ. Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch chiết.
Nguyên liệu - Ngâm chiết trong MeOH/H2O (95/5)
3 lần
- Cất loại dung môi dưới áp suất thấp
Cao tổng - Chiết lần lượt với các dung môi: n-
hexane, ethyl acetate, n-buthanol - Cất loại dung môi dưới áp suất thấp
Cao n- hexane 9,0g Cao EtOAc 14,2g Cao BuOH 12g
-Lần 3: Cho 2 lít dung dịch MeOH/H2O (95:5) vào bã nguyên liệu đã chiết lần 2, ngâm khoảng 12 giờ. Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 2 giờ. Sau đó lọc lấy dịch chiết.
Gộp dịch chiết của 3 lần chiết, cất loại dung môi thu được cao tổng.
ØĐiều chế cao n-hexane, EtOAc và cao BuOH
Cao tổng được cho thêm nước rồi đưa vào phễu chiết, chiết phân lớp lần lượt với n-hexane, EtOAc và BuOH.
o Phân lớp với n-hexane, chiết 3 lần, với khoảng 2 lít n-hexane. Tổng dịch chiết khoảng 2000 ml, cất loại dung môi thu được 9,0g cao n-hexane.
o Phân lớp với EtOAc, chiết 3 lần, với khoảng 2 lít EtOAc. Tổng dịch chiết khoảng 2000 ml, cất loại dung môi thu được 14,2g cao EtOAc.
o Phân lớp với BuOH, chiết 3 lần, với khoảng 1,5 lít BuOH. Tổng dịch chiết 1500 ml, cất loại dung môi thu được 12,0g cao BuOH.
2.4. ĐỊNH DANH MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CÁC CAO
Đo phổ GC/MS tại trung tâm đo lường chất lượng II Đà Nẵng để xác định một số hợp chất có trong các cao.
2.5. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CAO BuOH
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập cao BuOH
Cao BuOH CC, silica gel, DCM/M/H2O = 4:1:0,1 F4 251mg CC, sephadex, DCM/M=1:9 HPB2 10mg F5 242mg CC, sephadex, DCM/M=1:9 F5.1 80mg F5.1.1 40mg CC, silica gel, DCM/M/H2O = 3,5:0,8:0,05 CC, sephadex, DCM/M=1:9 HPB4 20mg
2.5.1. Chạy cột sắc ký phần cao BuOH
Lấy 12,0g cao BuOH hòa tan vào dung môi BuOH trong bình cầu 250ml, sau khi chấm bản mỏng để tìm hệ dung môi thích hợp để chạy cột, ta thêm silica gel (khoảng 15g) vào, quay cất dưới áp suất thấp đến khô hoàn toàn để
chất gắn đều lên silica gel. Làm tơi mịn phần silica gel đã gắn bằng cối và chày sứ để nạp vào cột sắc ký.
üChuẩn bị cột sắc ký
Cho hệ dung môi DCM:MeOH:H2O = 4:1:0,1 vào ca nhựa (lựa chọn dựa vào sắc ký bản mỏng).
Lượng silica gel (Merck, 0,04 – 0,063 mm) lấy khoảng 120g cho vào ca nhựa trên và khuấy.
Cho mẫu bông nhỏ vào đáy cột.
Silica gel được cho vào cột bằng cách nhồi ướt.
üNạp mẫu vào cột
Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp khô. Mẫu khô đã tơi mịn được
đưa vào cột sắc ký từ từ thông qua phễu sau khi đã khóa cột. Chú ý khi cho mẫu vào cột theo phương pháp khô thì lượng dung môi phải vừa đủ, không quá nhiều; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silica gel; mẫu phải thấm ướt đều dung môi, không có bọt khí.
üChạy cột silica gel với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O với tỷ lệ độ
phân cực tăng dần từ 4:1:0,1 đến 2:1:0,1, thu được 10 phân đoạn được ký hiệu từ F1 đến F10 với tổng lượng chất 9g.
Trong đó, một số phân đoạn có vệt rõ, xuất hiện chất khi chạy thử trên sắc ký bản mỏng, đó là các phân đoạn F3, F4, F5, F6, F9 và F10. Dựa vào bản mỏng, ta thấy các phân đoạn F4 và F5 có nhiều vệt chất với Rf tương đối giống nhau nên được chọn để tiếp tục chạy sắc ký.
2.5.2. Chạy cột sắc ký phân đoạn F4
Lấy 251mg phân đoạn F4 hòa tan trong MeOH để chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM: MeOH (1:9) thu được chất sạch, xuất hiện vệt tròn khi chạy trên bản mỏng (kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O = 3,5:1:0,1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khô cho vệt màu. Cô đuổi dung môi thu được 10mg chất sạch, ký hiệu HPB2. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOD, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOD, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc, thu
được kết quả: - Phổ1H-NMR (MeOD, 500MHz), δ ppm, J (Hz): 7,95 (1H, d, J=2); 7,64 (1H, J=2 và J=8,5); 6,93 (1H, d, J=8,5); 6,41 (1H, d, J=1,5); 6,22 (1H, d, J=1,5); 5,24 (1H, d, J=7,5); 4,55 (1H, d, J=1,0), 9,96 (3H, s); 1,12 (3H, d, J=7,5). - Phổ 13C-NMR (MeOD, 125MHz), δ ppm: 179,31; 166,01; 162.94; 158,88; 158,46; 150,82; 148,31; 135,47; 124,00; 122,99; 116,10; 114,57; 105,69; 104,42; 102,49; 99,99; 94,94; 78,15; 77,33; 75,90; 73,83; 72,28; 72,05; 71,60; 69,77; 68,53; 56,79; 17,86. 2.5.3. Chạy cột sắc ký phân đoạn F5
Lấy 242mg phân đoạn F5 hòa tan trong MeOH để chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM/MeOH (1:9) thu được 8 phân đoạn, được ký hiệu từ F5.1 đến F5.8 với tổng lượng chất 225mg.
Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn F5.1 (80mg) có nhiều vệt chất tròn nên được lựa chọn để tiếp tục chạy cột sắc ký.
Tiến hành chạy cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (3,5: 0,8: 0,05) thu được 5 phân đoạn được ký hiệu từ
Dựa vào bản mỏng của các phân đoạn, ta thấy phân đoạn F5.1.1 có nhiều vệt chất tròn chồng lên nhau, do đó cho phân đoạn F5.1.1 chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM/MeOH (1:9).
Tiến hành chấm bản mỏng, thấy xuất hiện vệt chất trong và rõ (kiểm tra với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (3,5: 0,8, 0,05) cho Rf= 0,4), phun thuốc thử vanilin/H2SO4, sau đó sấy khô cho vệt chất màu. Cô đuổi dung môi thu
được 40mg chất sạch, được ký hiệu HPB4. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOD, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOD, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, MeOD)
để xác định cấu trúc, thu được kết quả như sau:
- Phổ1H-NMR ( MeOD, 500MHz), δ ppm, J (Hz): 7,53 (1H, s); 5,83 (1H, s); 5,12 (1H, d, J=6); 4,69 (1H, d, J=8); 4,57 (1H, brd); 4,21 và 4,35 (2H, brd, J=15,5); 3,77 (3H, s); 3,66 và 3,87 (2H, d, J=11); 3,30 đến 3,41 (m); 3,23 (1H, dd, J=8 và J=9); 3,04 (1H, dd, J=5,5); 3,02 (m). - Phổ 13C-NMR (MeOD, 125MHz), δ ppm: 170,29; 153,86; 147,52; 130,09; 110,81; 100,29; 98,30; 82,64; 78,41; 77,86; 74,77; 71,52; 62,68; 61,03; 52,03; 47,13; 45,59. 2.6. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
Các chất HPB2 và HPB4 đã phân lập được được đem xác định hoạt tính sinh học gồm hoạt tính kháng sinh và hoạt tính độc tế bào tại phòng Hóa sinh
ứng dụng – Viện hóa học.
2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
a. Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở người
Vi khuẩn : Gram (-) Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442 E. Coli (Ec) ATCC 25922
Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633
Lactobasillus fermentum N4 Enterococus faecium B650 Nấm: Candida albicans (Ca) ATCC 10231
b. Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller- Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm.
c. Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng
độ).
- Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ
khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256 μg/ml; 64μg/ml; 16μg/ml; 4μg/ml; 1μg/ml.
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5. 105 cfu/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 370C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức