Lấy 251mg phân đoạn F4 hòa tan trong MeOH để chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM: MeOH (1:9) thu được chất sạch, xuất hiện vệt tròn khi chạy trên bản mỏng (kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O = 3,5:1:0,1 cho Rf = 0,35), phun thuốc thử vanilin/H2SO4 sau đó sấy khô cho vệt màu. Cô đuổi dung môi thu được 10mg chất sạch, ký hiệu HPB2. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOD, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOD, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, CDCl3) để xác định cấu trúc, thu
được kết quả: - Phổ1H-NMR (MeOD, 500MHz), δ ppm, J (Hz): 7,95 (1H, d, J=2); 7,64 (1H, J=2 và J=8,5); 6,93 (1H, d, J=8,5); 6,41 (1H, d, J=1,5); 6,22 (1H, d, J=1,5); 5,24 (1H, d, J=7,5); 4,55 (1H, d, J=1,0), 9,96 (3H, s); 1,12 (3H, d, J=7,5). - Phổ 13C-NMR (MeOD, 125MHz), δ ppm: 179,31; 166,01; 162.94; 158,88; 158,46; 150,82; 148,31; 135,47; 124,00; 122,99; 116,10; 114,57; 105,69; 104,42; 102,49; 99,99; 94,94; 78,15; 77,33; 75,90; 73,83; 72,28; 72,05; 71,60; 69,77; 68,53; 56,79; 17,86. 2.5.3. Chạy cột sắc ký phân đoạn F5
Lấy 242mg phân đoạn F5 hòa tan trong MeOH để chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM/MeOH (1:9) thu được 8 phân đoạn, được ký hiệu từ F5.1 đến F5.8 với tổng lượng chất 225mg.
Dựa vào bản mỏng, ta thấy phân đoạn F5.1 (80mg) có nhiều vệt chất tròn nên được lựa chọn để tiếp tục chạy cột sắc ký.
Tiến hành chạy cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (3,5: 0,8: 0,05) thu được 5 phân đoạn được ký hiệu từ
Dựa vào bản mỏng của các phân đoạn, ta thấy phân đoạn F5.1.1 có nhiều vệt chất tròn chồng lên nhau, do đó cho phân đoạn F5.1.1 chạy cột sắc ký Sephadex với hệ dung môi DCM/MeOH (1:9).
Tiến hành chấm bản mỏng, thấy xuất hiện vệt chất trong và rõ (kiểm tra với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (3,5: 0,8, 0,05) cho Rf= 0,4), phun thuốc thử vanilin/H2SO4, sau đó sấy khô cho vệt chất màu. Cô đuổi dung môi thu
được 40mg chất sạch, được ký hiệu HPB4. Đem đo phổ 1H – NMR (MeOD, 500 MHz), phổ 13C –NMR (MeOD, 125MHZ), phổ DEPT (125MHz, MeOD)
để xác định cấu trúc, thu được kết quả như sau:
- Phổ1H-NMR ( MeOD, 500MHz), δ ppm, J (Hz): 7,53 (1H, s); 5,83 (1H, s); 5,12 (1H, d, J=6); 4,69 (1H, d, J=8); 4,57 (1H, brd); 4,21 và 4,35 (2H, brd, J=15,5); 3,77 (3H, s); 3,66 và 3,87 (2H, d, J=11); 3,30 đến 3,41 (m); 3,23 (1H, dd, J=8 và J=9); 3,04 (1H, dd, J=5,5); 3,02 (m). - Phổ 13C-NMR (MeOD, 125MHz), δ ppm: 170,29; 153,86; 147,52; 130,09; 110,81; 100,29; 98,30; 82,64; 78,41; 77,86; 74,77; 71,52; 62,68; 61,03; 52,03; 47,13; 45,59. 2.6. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
Các chất HPB2 và HPB4 đã phân lập được được đem xác định hoạt tính sinh học gồm hoạt tính kháng sinh và hoạt tính độc tế bào tại phòng Hóa sinh
ứng dụng – Viện hóa học.
2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
a. Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định
Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở người
Vi khuẩn : Gram (-) Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442 E. Coli (Ec) ATCC 25922
Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633
Lactobasillus fermentum N4 Enterococus faecium B650 Nấm: Candida albicans (Ca) ATCC 10231
b. Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller- Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm.
c. Phương pháp: Phương pháp pha loãng nồng độ
- Mẫu ban đầu được pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.
- Các mẫu được pha thành dãy các nồng độ khác nhau (từ 5 đến 10 nồng
độ).
- Mẫu ban đầu có nồng độ 40 mg/ml được pha loãng thành các nồng độ
khác nhau để thử hoạt tính với các chủng: 256 μg/ml; 64μg/ml; 16μg/ml; 4μg/ml; 1μg/ml.
- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5. 105 cfu/ml khi tiến hành thử.
- Lấy 10μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã pha loãng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ ở 370C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằng mắt thường. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.
d. Chất tham khảo
- Kháng sinh Ampicilin cho các chủng vi khuẩn gram (+) và chủng vi khuẩn Ec gram (-) với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 μg/ml.
- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Step cho chủng vi khuẩn Pa gram (-) với giá trị
IC50 trong khoảng 4 – 5 μg/ml.
- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 μg/ml.
2.6.2. Hoạt tính gây độc tế bào
a. Các dòng tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm :
- KB (Humam epidermic carcinoma), ung thư biểu mô – là dòng luôn
được sử dụng trong các phép thửđộ độc tế bào.
- Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) – ung thư gan - LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi
- MCF – 7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.
b. Phương pháp: phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế
bào ung thưở điều kiện in vitro.
- Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.
c. Thửđộc tế bào
- Cho 200 μl dung dịch tế bào ở pha lỏng nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1.
- Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128μg/ml; 32μg/ml; 8μg/ml; 2μg/ml; 0,5μg/ml. Ủ trong điều kiện 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày.
- Giếng điều khiển gồm 200 μl dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml,
ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50μl MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 37 0C 4 giờ.
- Loại bỏ môi trường, thêm 100μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
d. Tính kết quả
GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển ( Growth Inhibidion).
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ 3.1.1. Độẩm Cốc 1 Cốc 2 Cốc 3 Cốc 4 Cốc 5 mo (g) 32,711 32,811 35,807 38,052 32,576 m1 (g) 34,711 34,811 37,807 40,052 34,576 m2 (g) 34,419 34,513 37,533 39,743 34,272 W (%) 85,4 85,1 86,3 84,6 84,8 Vậy độ ẩm của mẫu nguyên liệu: = = 85,24%
Như vậy, mẫu nguyên liệu tươi có độẩm khoảng 85,24%. Nguyên liệu có
độẩm tương đối, cần phơi, sấy khô để dễ dàng bảo quản. 3.1.2. Hàm lượng tro Cốc 1 Cốc 2 Cốc 3 Cốc 4 Cốc 5 mo (g) 32,711 32,811 35,807 38,052 32,576 m1 (g) 2 2 2 2 2 m2 (g) 32,857 32,892 35,915 38,137 32,654 X (%) 4,3 4,1 4,3 4,3 3,9
Hàm lượng tro của mẫu nguyên liệu:
X= = 4,2%
Trong mẫu nguyên liệu chỉ chứa 4,2% hàm lượng chất vô cơ như kim loại, và hàm lượng chất hữu cơ trong mẫu là khoảng 95,8%.
3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC CAO 3.2.1. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 3.2.1. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane
Sắc ký đồ GC/MS của dịch chiết n-hexane của cây An điền lá thông được trình bày trong hình 3.1.
Kết quả phân tích sắc ký đồ GC/MS và so sánh với thư viện chuẩn cho thấy có 7/7 cấu tử được định danh chiếm 46,12%.
Thành phần hóa học chính trong dịch chiết n-hexane của loài An điền lá thông được trình bày qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane
STT TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo 1 29,813 2,08 Acid 2- hexadecanoic C16H32O2 2 33,688 4,27 Phytol C20H40O HO 3 41,072 24,81 Squalene C30H50 4 43,388 3,70 Vitamin E C29H50O2 5 44,504 3,31 Campesterol C28H48O 6 44,793 3,99 Stigmasterol C29H48O HO 7 45,524 3,96 β-sitosterol C29H50O HO
Từ bảng 3.1 cho thấy, các cấu tử đã định danh với hàm lượng lớn bao gồm: squalene (24,81%), phytol (4,27%), stigmasterol (3,99%), β-sitosterol (3,96%), vitamin E (3,70%), campesterol (3,31%) và acid n-hexadecanoic (2,08%).
Trong các chất trên: chất stigmasterol, β-sitosterol, campesterol là các chất sterol là lớp chất phổ biến trong thực vật, có nhiều hoạt tính... Stigmasterol là chất chống oxi hóa mạnh, có tác dụng hạ đường huyết, chống viêm khớp, làm giảm cholesterol và đặc biệt là có tác dụng phòng chống ung thư ruột kết, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư buồng trứng . Bên cạnh đó, campesterol là chất có tác dụng chống viêm, làm ức chế quá trình gây viêm xương khớp, làm giảm hấp thụ cholesterol trong ruột, đặc biệt có tác dụng giảm xơ vữa động mạch, phòng chống các bệnh về tim mạch [32].
Vitamin E còn gọi là tocopherol là một chất chống oxy hóa tốt, ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa, chống các loại ung thư, vitamin E còn làm giảm nồng độ cholesterol xấu trong máu, tăng cường tuần hoàn máu nên giảm các nguy cơ mắc các chứng bệnh về tim mạch, kých thích hệ thống miễn dịch hoạt động bảo vệ các tế bào [15].
Phytol là sản phẩm của quá trình trao đổi chất diệp lục ở thực vật. Nó
được được sử dụng để tổng hợp các vitamin thiết yếu trong cơ thể con người, như vitamin E và vitamin K. Nó là chất cần thiết trong việc kých hoạt các enzym có tác dụng tích cực đến việc sản xuất insulin. Nó cũng có hiệu quả
trong việc giảm mức cholesterol trong máu và giảm huyết áp. Phytol cũng có lợi trong việc điều hòa lượng đường trong máu và có thể có thể khôi phục lại các chức năng trao đổi chất của người mắc bệnh tiểu đường loại 2 [45] .
Acid palmidic (acid n-hexadecanoic) là một trong những acid béo bão hòa phổ biến nhất được tìm thấy ở động vật và thực vật. Đây là chất chống oxy hóa nhẹ và có đặc tính chống xơ vữa động mạch [46].
Hình ảnh của một số phổ MS của các cấu tử chiếm tỷ lệ % diện tích pic lớn được trình bày trên các hình từ 3.2 đến hình 3.4:
Hình 3.2. Phổ khối của squalene
Hình 3.4. Phổ khối của stigmasterol
3.2.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết EtOAc
Sắc ký đồ GC/MS của dịch chiết EtOAc của cây An điền lá thông được trình bày như trong hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ của dịch chiết EtOAc của cây An điền lá thông
Kết quả phân tích sắc ký đồ GC/MS và so sánh với thư viện chuẩn cho thấy có 11/11 chất được định danh chiếm 76,43%.
Thành phần hóa học chính trong dịch chiết EtOAc của cây An điền lá thông được trình bày qua bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết EtOAc
STT TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo 1 7,212 0,50 Pantolacton C6H10O3 O HO H O 2 8,341 4,02 1,2,3-propanetriol monoacetate C5H10O4 O OH O OH 3 10,926 1,01 4-methyl benzaldehyde C8H8O CHO 4 11,343 4,77 1,2,3-propanetriol diacetate C7H12O5 O O O O OH 5 29,736 5,73 Acid n- hexadecanoic C16H32O2 6 33,662 5,21 Phytol C20H40O HO 7 41,059 31,54 Squalene C30H50 8 43,368 5,95 Vitamin E C29H50O2
9 44,485 5,29 Campesterol C28H48O 10 44,761 5,89 Stigmasterol C29H48O 11 45,498 6,52 β-sitosterol C29H50O HO
Từ bảng 3.2 cho thấy, các cấu tử đã được định danh với hàm lượng lớn bao gồm: squalene (31,54%), β-sitosterol (6,52%), vitamin E (5,95%), stigmasterol (5,89%), acid n-hexadecanoic (5,73%), campesterol (5,29%), phytol (5,21%), 1,2,3-propanetriol diacetate (4,77%), 1,2,3-propanetriol monoacetate (4,02%), 4-methyl benzaldehyde (1,01%) và pantolacton (0,05%).
Hình ảnh của một số phổ MS của các cấu tử chiếm tỷ lệ % diện tích pic lớn được trình bày trên các hình 3.6 và 3.7:
Hình 3.7. Phổ khối của 1,2,3-propanetriol monoacetate
3.2.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết MeOH
Sắc ký đồ GC/MS của dịch chiết EtOAc của cây An điền lá thông được trình bày như trong hình 3.8.
Kết quả phân tích sắc ký đồ GC/MS và so sánh với thư viện chuẩn cho thấy có 11/11 chất được định danh chiếm 80,02%.
Thành phần hóa học chính trong dịch chiết MeOH của cây An điền lá thông được trình bày qua bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết MeOH
STT TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo 1 3,876 0,62 2-Furanmethanol C5H6O2 O OH 2 9,367 5,50 2,3-dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl 4H-pyran-4-on C6H8O4 O HO O OH 3 11,106 8,36 5-hydroxymethyl-2- furancarboxaldehyde C6H6O3 O O HO 4 29,698 13,97 Acid n-hexadecanoic C16H32O2 5 33,649 4,35 Phytol C20H40O HO 6 34,586 4,11 Acid (Z,Z)-9,12- octadecadienoic C18H32O2 HO O 7 41,053 21,70 Squalene C30H50 8 43,361 6,17 Vitamin E C29H50O2
9 44,478 4,74 Campesterol C28H48O 10 44,754 4,53 Stigmasterol C29H48O HO 11 45,479 5,97 β-sitosterol C29H50O HO
Từ bảng 3.3 cho thấy, các cấu tử đã định danh với hàm lượng lớn bao gồm: squalene (21,7%), acid n-hexadecanoic (13,97%), 5-hydroxymethyl-2- furancarboxaldehyde (8,36%), vitamin E (6,17%), β-sitosterol (5,97%), 2,3- dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-on (5,50%), campesterol (4,74%), stigmasterol (4,53%), phytol (4,35%), acid (Z,Z)-9,12- octadecadienoic (4,11%) và 2-furanmethanol (0,62%).
Hình ảnh của một số phổ MS của các cấu tử chiếm tỷ lệ % diện tích pic lớn được trình bày trên các hình 3.9 và 3.10:
Hình 3.10. Phổ khối của 2-Furanmethanol
Như quan sát, trong các dịch chiết được đem đi xác định thành phần bằng GC/MS thấy có thêm squalene so với các nghiên cứu trước [7], điều đó cho thấy, điều kiện địa lý, thổ nhưỡng khác nhau sẽ dẫn đến sự khác nhau về
thành phần cũng như hàm lượng các chất có trong cây.
3.3.CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.3.1. Cấu trúc của chất HPB2
Số liệu trên phổ 1H-NMR và phổ 1H-NMR giãn rộng của chất HPB2 cho thấy có 13 tín hiệu proton trong phân tử HPB2. Số liệu 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 28 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và so sánh số liệu phổ với số liệu của chất chuẩn [22] cho phép sự đoán chất HPB2 là isorhamnetin-3-O-β-D- rutinoside (C28H32O16, M=624). O HO OH O OH O OH OH OH HO 2 3 4 5 7 9 1' 3' 5' 2"' 3"' 4"' 5"' 6"' O O OH OH 1" 2" 3" 5" 6" O OMe
Cấu trúc của hợp chất HPB2được khẳng định thông qua việc phân tích số
liệu phổ: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC và HSQC như sau:
ØPhổ1H-NMR (MeOD, 500MHz)
Phổ 1H-NMR của chất này gồm hai phần, phần aglycon và phần đường. Các tín hiệu của phần aglycon đặc trưng cho một flavone, thể hiện qua các tín hiệu proton thơm ở các độ dịch chuyển 7,95 (1H, d, 2Hz), 7,64 (1H, dd, 2 và 8,5Hz), 6,93 (1H, d, 8,5Hz), 6,41 (1H, d, 1,5Hz), 6,22 (1H, d, 1,5Hz). Các tín hiệu này được gán cho các proton tương ứng là H-2’, H-6’, H-5’, H-8 và H-6. Các tín hiệu trong phổ1H-NMR cho phép xác định phần đường trong phân tử
gồm rhamnosyl và glucosyl thông qua các tín hiệu proton anomer tương ứng
ở δH = 5,24ppm (1H, d, 7,5Hz) và δH = 4,55ppm (1H, d, 1Hz) cùng với các tín hiệu nhận dạng tín hiệu của nhóm methyl ở δH = 1,12ppm (3H, d, 7,5Hz) của gốc rhamnosyl. Hằng số tương tác của các proton anomer trong 2 đơn vị đường cho phép xác định đó là β-glucose và α-rhamnose. Ngoài ra, tại δ = 3,96ppm (3H, s) còn xuất hiện tín hiệu của nhóm methoxy.
ØPhổ13C-NMR (MeOD, 125MHz) và DEPT
Bên cạnh đó, dựa trên các phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135, chúng tôi nhận thấy HPB2 có 28 nguyên tử C, trong đó có 1 nhóm CH3, 1 nhóm OCH3, 1 nhóm CH2, 15 nhóm CH và 10 C bậc 4, đặc trưng của một flavanoid glycoside. Tín hiệu của 10 carbon vòng thơm xuất hiện khoảng δ = 105,69 – 179,38ppm. Tín hiệu của carbonyl liên hợp C-4 xuất hiện tại δ = 179,38ppm. Tín hiệu của nhóm methylen xuất hiện tại δ = 68,53ppm. Ở trường thấp, xuất hiện tín hiệu của nhóm methyl tại δ = 17,86ppm và tín hiệu của nhóm methoxy ở δ = 56,79ppm. Các tín hiệu còn lại của cacbon glycosyl và rhamnosyl.