5. Cấu trúc luận văn
2.1. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP NANO BẠC
2.1.1. Hóa chất thí nghiệm sử dụng
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại hóa chất tinh khiết, không cần qua tinh chế lại.
AgNO3 : xuất xứ Trung Quốc.
Natri citrat: xuất xứ Nhật
Nước cất 2 lần: Việt Nam
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
Dụng cụ thủy tinh: Ống đong, pipet các loại, bình nón, bình cầu, đũa khuấy, nhiệt kế …
Máy khuấy từ gia nhiệt
Quang phổ hấp thụ phân tử UV-vis
Nhiễu xạ tia X
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
2.1.3. Quy trình tổng hợp hạt nano bạc
Có nhiều phương pháp khác nhau để điều chế AgNP. Với mục tiêu thu được dung dịch keo AgNP có kích thước bé, đồng nhất và bền, chúng tôi sử dụng phương pháp hoá học trên cơ sở chất ban đầu là AgNO3 và Natri citrat là tác nhân khử, đồng thời là chất làm bền. Quy trình tổng hợp AgNP được thực hiện như sau:
Cho dung dịch 125 ml AgNO3 1mM vào cốc thủy tinh, đặt trên máy khuấy từ gia nhiệt đến nhiệt độ phản ứng.
Thêm từ từ Natri citrat, giữ hỗn hợp phản ứng được khuấy liên tục ở nhiệt độ phản ứng trong một khoảng thời gian xác định.
Dung dịch phản ứng chuyển từ không màu sang vàng nhạt rồi vàng sẫm chứng tỏ có sự tạo thành dung dịch keo AgNP. Dung dịch keo AgNP được để nguội đến nhiệt độ phòng và lưu giữ ở 4oC đến khi sử dụng [12].
2.1.4. Tối ưu hóa quá trình điều chế AgNP từ chất khử Natri citrat
Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến AgNP tạo ra như thể tích Natri citrat, thời gian khuấy và nhiệt độ của phản ứng.
2.2.PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TRƯNG CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC ĐÃ TỔNG HỢP
2.2.1. Đặc trưng cộng hưởng plasmon của hạt keo AgNP
Các hạt AgNP có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Hiện tượng này tạo nên màu sắc của dung dịch keo AgNP từ vàng nhạt đến nâu đen, do màu sắc của dung dịch keo phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt.
Đặc trưng cộng hưởng plasmon bề mặt của các hạt AgNP được xác định bằng cách đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trong khoảng bước sóng từ 350 - 600 nm.
Mẫu đo được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch AgNP đã điều chế với nước cất 2 lần theo tỉ lệ thể tích AgNP : H2O = 1 : 2. Hỗn hợp được cho vào cuvet và ghi lại phổ trên máy đo quang phổ hấp thụ UV- Vis ở nhiệt độ phòng.
2.2.2. Hình dạng và kích thước của AgNP
Hình dạng và kích thước của các hạt AgNP được xác định thông qua chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có độ phân giải cao trên máy JEOL JEM 1100 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Mẫu được nhỏ trên tấm lưới đồng, được làm khô qua đêm trước khi tiến hành đo.
2.2.3. Cấu trúc tinh thể của hạt keo AgNP
Cấu trúc tinh thể của các hạt AgNP được xác định bằng nhiễu xạ tia X trên máy Bruker AXS D8 Advance. Dung dịch keo nano bạc được ly tâm với tốc độ cao, thu lấy phần không tan, sấy khô, sau đó để tiến hành đo nhiễu xạ tia X.
2.3.ĐIỀU CHẾ CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC 2.3.1. Hóa chất thí nghiệm sử dụng 2.3.1. Hóa chất thí nghiệm sử dụng
Các hóa chất sử dụng để điều chế WSC, thuộc loại hóa chất tinh khiết, không cần qua tinh chế lại được thể hiện ở .
Bảng 2.1 Danh sách các hóa chất sử dụng điều chế WSC
Tên hóa chất Công thức Hãng sản xuất
Nước cất 2 lần H2O Việt Nam
Chitosan Việt Nam
Axit axetic CH3COOH Trung Quốc
Hyđro peoxit H2O2 Trung Quốc
Natri hiđroxit NaOH Trung Quốc
Etanol C2H5OH Việt Nam
2.3.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
Cốc thủy tinh 50ml Đũa khuấy
Cốc thủy tinh100ml Nhiệt kế 100ºC
Ống đong 50ml Giấy đo pH
Bình định mức 50ml Cân phân tích
Bình định mức 100ml Giấy lọc
Pipet 2ml Phễu lọc
Pipet 5ml Phễu buchner
Pipet 10ml Giấy nhôm
Máy khuấy từ gia nhiệt Máy sấy
Phổ hồng ngoại IR Máy đo độ nhớt
2.3.3. Quy trình điều chế WSC
Chitosan dùng trong thí nghiệm này được mua từ Công ty TNHH MTV Chitosan Việt Nam có DDA = 81,3 % và hàm lượng khoáng là 1,57%. Tiến hành điều chế WSC như sơ đồ Hình 2.1. Đầu tiên cân 1gam Chitosan cho vào cốc thủy tinh, cho 20ml dung dịch axit axetic 2% rồi khuấy đều để hòa tan hoàn toàn chitosan. Tiếp theo, dung dịch H2O2 (4 – 6%) được thêm vào cốc, sau đó được khuấy trên máy khuấy từ trong 2 – 4 giờ, ở nhiệt độ từ 20oC – 60ºC.
Sau khi thực hiện xong phản ứng, dung dịch được trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% đến pH = 7. Phần chitosan không tan trong nước sẽ nổi lên trên, lọc bỏ phần nổi lên, thu phần dịch lọc.
Sau đó, thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch lọc, sấy qua đêm ở 50ºC. Phần WSC sau khi đem sấy sẽ nổi lên trên. Lọc lấy phần nổi, sấy khô ở nhiệt độ phòng thu được WSC .
Hiệu suất tạo WSC: H% = 𝑆ố 𝑔𝑎𝑚 𝑊𝑆𝐶
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình điều chế WSC
2.3.4. Tối ưu hóa quá trình điều chế WSC
Sau khi tổng hợp WSC, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng WSC tạo ra như nồng độ H2O2, thời gian khuấy và nhiệt độ của phản ứng và dựa vào hiệu suất phản ứng chuyển hóa để chọn điều kiện điều chế WSC hiệu quả nhất.
2.4.PHÂN TÍCH ĐẶC TRƯNG CỦA WSC ĐÃ TỔNG HỢP 2.4.1. Phổ hồng ngoại 2.4.1. Phổ hồng ngoại
Cấu trúc của WSC được tạo ra từ chitosan được xác định bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) trong vùng từ 400 4000 cm-1. Vùng này sẽ cho ta
1.Trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% 2. Lọc bỏ kết tủa
3. Thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
1. Sấy qua đêm ở 50ºC
2. Lọc lấy kết tủa, sấy ở nhiệt độ phòng
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
Chitosan
Dung dịch Chitosan
Chitosan được phân cắt mạch
WSC
1. Dung dịch CH3COOH 2%
2. Khuấy
1. Dung dịch H2O2 (4-6%)
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
Dung dịch chứa Chitosan hòa tan
những thông tin quan trọng về dao động của các phân tử, đó là thông tin về cấu trúc của phân tử. Chất nghiên cứu (2-5mg) được nghiền nhỏ, trộn với bột KBr khan rồi ép thành tấm mỏng. Đặt tấm mỏng vào cuvet để ghi phổ. Dựa vào phổ, cho phép khẳng định sự có mặt của các nhóm chức trong WSC.
2.4.2. Phương pháp đo độ nhớt
a. Độ nhớt động học
Thời gian chảy đo được của một thể tích chất lỏng không đổi dưới tác dụng của trọng lực chảy qua mao quản của nhớt kế đã hiệu chuẩn ở nhiệt độ cho trước được kiểm soát. Độ nhớt động học là tích của thời gian chảy đo được và hằng số hiệu chuẩn nhớt kế.
Hình 2.2 Cấu tạo của nhớt kế ống mao quản
b. Cách tiến hành
Nạp mẫu vào nhớt kế theo thiết kế của thiết bị đã hiệu chuẩn.
Để nhớt kế đã nạp mẫu trong bể giữ nhiệt để đạt đến nhiệt độ thí nghiệm trong khoảng thời gian 30 phút để cân bằng nhiệt độ.
Điều chỉnh mẫu thử đến vị trí trong nhánh mao quản cao hơn vạch mức đo thời gian thứ nhất khoảng 7 mm. Để mẫu chảy tự do, đo thời gian của mặt
khum chất lỏng chảy từ vạch dấu thứ nhất đến vạch dấu thứ 2, thời gian tính bằng giây, sai số đến 0,1 giây.
c. Mối liên hệ giữa độ nhớt và khối lượng phân tử trung bình
Độ nhớt và phân tử khối trung bình của polyme có mối liên hệ theo hệ thức Mark – Houwink
K M. Trong đó:
: Độ nhớt của polyme
M : Phân tử khối trung bình của polyme (g/mol)
K, α: Những hằng số phụ thuộc vào bản chất polyme và dung môi
Như vậy, từ hệ thức trên ta thấy rằng, những polyme có phân tử khối trung bình càng lớn thì độ nhớt càng cao và ngược lại. Nói cách khác, độ nhớt của WSC sẽ nhỏ hơn độ nhớt của Chitosan.
2.5.CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU TỔ HỢP CHITOSAN – AgNP– CURCUMIN VẬT LIỆU TỔ HỢP CHITOSAN – AgNP– CURCUMIN
2.5.1. Chế tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
Chúng tôi tiến hành phối trộn AgNP, WSC và Curcumin để tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin theo sơ đồ Hình 2.3.
Đầu tiên, cân 1 gam curcumin hòa tan vào 1ml cồn tuyệt đối, khuấy trộn đều tạo thành dung dịch lỏng sệt.
Thêm 2 gam WSC đã điều chế vào hỗn hợp trên, tiếp theo cho thêm vào 3ml dung dịch nano bạc đã tổng hợp rồi khuấy trộn kĩ để tạo hỗn hợp đồng nhất.
Đóng kín và bảo quản hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin ở điều kiện thích hợp cho đến khi sử dụng.
Hình 2.3 Sơ đồ tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
2.5.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin Chitosan – AgNP – Curcumin
Kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). Vì vậy, thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được xác định dựa vào việc ghi lại phổ tán xạ năng lượng tia X.
2.5.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
Tính kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được đánh giá thông qua khả năng ức chế của nó đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên môi trường nuôi cấy agarose.
Curcumin
Hỗn hợp lỏng sệt
Vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
1. Dung dịch cồn tuyệt đối 2. Khuấy trộn
1. WSC
2. dung dịch nano bạc 3. Khuấy trộn
a. Chuẩn bị môi trường cấy
Thạch Mueller-Hinton
Sử dụng thạch Mueller – Hinton để làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton theo các bước như sau:
Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.
Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần. Nếu pH nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác.
Hấp tiệt trùng môi trường thạch ở 121oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50°C.
Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch). Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng. Không đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm vì nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng khuẩn giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.
Khoanh giấy kháng sinh
Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường. Các khoanh giấy kháng sinh được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo.
Nước muối sinh lý NaCl 0.9%
Nước muối sinh lý NaCl 0.9% có pH = 7, sấy khử trùng 121°C trong 15 phút và được bảo quản trong chai vặn kín, để ở nhiệt độ phòng.
b. Quy trình thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin
Thuyết minh sơ đồ Hình 2.4 :
(1)Chủng vi khuẩn gốc
Hai chủng vi khuẩn gốc Escherichia coli (E. Coli) và Staphylococcus aureus (S. aure) được cung cấp từ Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đà Nẵng trong môi trường nuôi cấy thạch nghiêng.
(2)Khuẩn lạc đơn
Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trước 1 ngày được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế và ủ các đĩa thạch ở 37°C trong vòng 24 giờ trong tủ ấm để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
(3)Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí
Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý NaCl 0.9 % vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.
(4) Cấy trải vi khuẩn lên đĩa thạch
Sử dụng ngay huyền dịch đã chuẩn bị láng đều lên mặt thạch Mueller- Hinton chứa trong đĩa petri và hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.
Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
(5) Đặt khoanh giấy kháng sinh
Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt (trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch).
Chuẩn vi khuẩn gốc
Khuẩn lạc đơn
Huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch
Mueller-Hinton Đặt khoanh giấy kháng sinh Đo vòng kháng khuẩn Phân tích kết quả (1) (2) (3) (4) (5) (6) (6) (7)
Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch. Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
Dùng micropipet nhỏ lần lượt mỗi 10 µl dung dịch nano bạc đã điều chế cũng như vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin lên mỗi khoanh giấy. Sau đó để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các dung dịch từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm ở 37°C trong vòng 24 giờ.
(6) Đo vòng kháng khuẩn
Lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước kẻ đến đơn vị milimet.
(7) Phân tích kết quả
Dựa vào sự xuất hiện vòng kháng khuẩn để đánh giá các dung dịch có kháng khuẩn hay không đối với mỗi chủng vi khuẩn thử. Nếu xuất hiện vòng kháng khuẩn bao quanh khoanh giấy kháng sinh chứng tỏ dung dịch được tẩm lên khoanh giấy có khả năng kháng khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.
2.5.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng trị bỏng
Để đánh giá khả năng trị bỏng của hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên thỏ:
Thỏ trưởng thành được cạo lông dọc 2 bên lưng
Dùng miếng thép tiết diện 1x1cm2, đốt nóng trên bếp gas trong 2 phút, sau đó gây bỏng 4 vết như nhau trên vùng cạo lông, rồi đánh dấu các vết bỏng theo thứ tự (1), (2), (3), (4).
+ Vết thứ 1: Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên.
+ Vết thứ 2: Sử dụng WSC được hòa tan trong nước bôi lên vết thương bỏng.
+ Vết thứ 3: Sử dụng hỗn hợp vật liệu WSC – AgNP bôi lên vết thương bỏng.
+ Vết thứ 4: Sử dụng hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên bôi lên vết thương bỏng.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.TỔNG HỢP NANO BẠC
3.1.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho quy trình tổng hợp AgNP
Tiến hành tổng hợp AgNP theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.1.3, ta thấy dung dịch phản ứng chuyển từ không màu sang vàng sẫm (Hình 3.1) chứng tỏ có sự tạo thành dung dịch keo AgNP.
Hình 3.1 Nano bạc đã được tổng hợp
Quá trình điều chế AgNP bằng phản ứng hoá học đi từ phản ứng oxi hoá khử chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố, gồm: nồng độ chất khử, thời gian, nhiệt độ, pH. Kết quả khảo sát từ các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình khử Ag+ để tạo AgNP đạt hiệu quả cao tại môi trường pH trung tính.