Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp

5. Cấu trúc luận văn

2.5.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp

2.5.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin Chitosan – AgNP – Curcumin

Kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). Vì vậy, thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được xác định dựa vào việc ghi lại phổ tán xạ năng lượng tia X.

2.5.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin hợp Chitosan – AgNP – Curcumin

Tính kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được đánh giá thông qua khả năng ức chế của nó đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên môi trường nuôi cấy agarose.

Curcumin

Hỗn hợp lỏng sệt

Vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin

1. Dung dịch cồn tuyệt đối 2. Khuấy trộn

1. WSC

2. dung dịch nano bạc 3. Khuấy trộn

a. Chuẩn bị môi trường cấy

 Thạch Mueller-Hinton

Sử dụng thạch Mueller – Hinton để làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton theo các bước như sau:

 Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.

 Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.

 Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần. Nếu pH nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác.

 Hấp tiệt trùng môi trường thạch ở 121oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50°C.

 Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch). Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng. Không đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm vì nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng khuẩn giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.

 Khoanh giấy kháng sinh

Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường. Các khoanh giấy kháng sinh được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo.

 Nước muối sinh lý NaCl 0.9%

Nước muối sinh lý NaCl 0.9% có pH = 7, sấy khử trùng 121°C trong 15 phút và được bảo quản trong chai vặn kín, để ở nhiệt độ phòng.

b. Quy trình thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin

Thuyết minh sơ đồ Hình 2.4 :

(1)Chủng vi khuẩn gốc

Hai chủng vi khuẩn gốc Escherichia coli (E. Coli) và Staphylococcus aureus (S. aure) được cung cấp từ Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đà Nẵng trong môi trường nuôi cấy thạch nghiêng.

(2)Khuẩn lạc đơn

Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trước 1 ngày được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế và ủ các đĩa thạch ở 37°C trong vòng 24 giờ trong tủ ấm để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.

(3)Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí

Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý NaCl 0.9 % vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.

(4) Cấy trải vi khuẩn lên đĩa thạch

Sử dụng ngay huyền dịch đã chuẩn bị láng đều lên mặt thạch Mueller- Hinton chứa trong đĩa petri và hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.

Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.

Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin

(5) Đặt khoanh giấy kháng sinh

Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt (trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch).

Chuẩn vi khuẩn gốc

Khuẩn lạc đơn

Huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý

Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch

Mueller-Hinton Đặt khoanh giấy kháng sinh Đo vòng kháng khuẩn Phân tích kết quả (1) (2) (3) (4) (5) (6) (6) (7)

Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch. Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.

Dùng micropipet nhỏ lần lượt mỗi 10 µl dung dịch nano bạc đã điều chế cũng như vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin lên mỗi khoanh giấy. Sau đó để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các dung dịch từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.

Đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm ở 37°C trong vòng 24 giờ.

(6) Đo vòng kháng khuẩn

Lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước kẻ đến đơn vị milimet.

(7) Phân tích kết quả

Dựa vào sự xuất hiện vòng kháng khuẩn để đánh giá các dung dịch có kháng khuẩn hay không đối với mỗi chủng vi khuẩn thử. Nếu xuất hiện vòng kháng khuẩn bao quanh khoanh giấy kháng sinh chứng tỏ dung dịch được tẩm lên khoanh giấy có khả năng kháng khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.