Phương pháp nghiên cứu khả năng trị bỏng

5. Cấu trúc luận văn

2.5.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng trị bỏng

Để đánh giá khả năng trị bỏng của hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên thỏ:

Thỏ trưởng thành được cạo lông dọc 2 bên lưng

Dùng miếng thép tiết diện 1x1cm2, đốt nóng trên bếp gas trong 2 phút, sau đó gây bỏng 4 vết như nhau trên vùng cạo lông, rồi đánh dấu các vết bỏng theo thứ tự (1), (2), (3), (4).

+ Vết thứ 1: Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên.

+ Vết thứ 2: Sử dụng WSC được hòa tan trong nước bôi lên vết thương bỏng.

+ Vết thứ 3: Sử dụng hỗn hợp vật liệu WSC – AgNP bôi lên vết thương bỏng.

+ Vết thứ 4: Sử dụng hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên bôi lên vết thương bỏng.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.TỔNG HỢP NANO BẠC

3.1.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho quy trình tổng hợp AgNP

Tiến hành tổng hợp AgNP theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.1.3, ta thấy dung dịch phản ứng chuyển từ không màu sang vàng sẫm (Hình 3.1) chứng tỏ có sự tạo thành dung dịch keo AgNP.

Hình 3.1 Nano bạc đã được tổng hợp

Quá trình điều chế AgNP bằng phản ứng hoá học đi từ phản ứng oxi hoá khử chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố, gồm: nồng độ chất khử, thời gian, nhiệt độ, pH. Kết quả khảo sát từ các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình khử Ag+ để tạo AgNP đạt hiệu quả cao tại môi trường pH trung tính.

Mặc khác, trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở ngưỡng nhiệt độ từ 70ºC đến 100ºC màu sắc của hỗn hợp phản ứng có sự thay đổi từ không màu sang vàng nhạt, vàng đậm đến vàng nâu.

a. Ảnh hưởng của thể tích Natri citrat

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích chất khử đến kích thước cũng như nồng độ của dung dịch keo AgNP tạo thành. Quá trình tổng hợp nano bạc được tiến hành theo quy trình ở mục 2.1.3 với những thể tích Natri citrat 1% khác nhau (4ml; 5ml; 6ml; 7ml; 8ml). Phản ứng được tiến hành ở 90oC trong vòng 15 phút. Mẫu của các dung dịch keo nano bạc đã tổng hợp được trình bày ở Hình 3.2. Kết quả đo quang phổ hấp thụ UV – Vis được trình bày ở Hình 3.3.

Theo thuyết Mie, đỉnh hấp thụ cực đại của hạt nano sẽ chuyển về vùng có bước sóng lớn khi kích thước hạt tăng lên, nồng độ hạt keo nano càng cao thì độ hấp thụ quang càng lớn [10].

Hình 3.3 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của AgNP được tổng hợp ở các thể tích khác nhau của Natri citrat

Từ đồ thị ở Hình 3.3 cho thấy trong khoảng thể tích Natri citrat từ 4 ÷ 8 ml, đỉnh hấp thụ cực đại phổ plasmon bề mặt của AgNP gần như không có sự thay đổi. Tuy nhiên, độ hấp thụ cực đại cao nhất khi thể tích Natri citrat là 6 ml. Vì thế, thể tích Natri citrat (1%wt) được lựa chọn để tổng hợp dung dịch keo AgNP là 6ml.

b. Ảnh hưởng của thời gian

Bên cạnh thể tích chất khử, thời gian cũng đóng vai trò quyết định đến kích thước của AgNP tạo thành. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp AgNP. Thí nghiệm được tiến hành như mục 2.1.3 với những thời gian khác nhau (5; 10; 15; 20 phút). Tỉ lệ các chất trong hỗn hợp là 125ml AgNO3 1mM và 6ml Natri citrat (1%wt), phản ứng được tiến hành ở 90oC và tốc độ khuấy được giữ không đổi. Sự thay đổi màu của hỗn hợp phản ứng và tín hiệu cộng hưởng plasmon bề mặt của các mẫu dung dịch keo nano bạc ở các thời gian khác nhau được thể hiện ở Hình 3.4 và Hình 3.5.

Hình 3.4 Màu sắc sản phẩm AgNP được tổng hợp ở những thời gian khác nhau

Hình 3.5 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của dung dịch keo AgNP được tổng hợp ở những thời gian khác nhau

Kết quả thể hiện ở Hình 3.5 cho thấy hàm lượng AgNP tăng dần theo thời gian phản ứng từ phút thứ 5 đến phút thứ 15, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ không màu sang vàng sẫm và đậm dần. Sau 15 phút và 20 phút kể từ lúc cho chất khử vào, đỉnh hấp thụ cực đại của AgNP cao nhất. Tuy nhiên,

cường độ hấp thụ tại khoảng thời gian 15 phút là lớn nhất nên thời gian phản ứng thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP là 15 phút.

c. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sau khi chọn được thể tích và thời gian tối ưu để tổng hợp AgNP, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến kích thước hạt AgNP tạo thành. Quá trình tổng hợp nano bạc được tiến hành như mục 2.1.3 với các nhiệt độ khác nhau (70oC; 80oC; 90oC; 100oC). Thể tích AgNO3 1mM là 125ml và Natri citrat 1% là 6ml được giữ không đổi. Phản ứng được tiến hành ở 90oC trong vòng 15 phút.

Hình 3.6 Màu sắc sản phẩm AgNP được tổng hợp ở những nhiệt độ khác nhau

Màu của dung dịch keo AgNP tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày ở Hình 3.6 và kết quả đo phổ cộng hưởng plasmon bề mặt được trình bày ở Hình 3.7.

Kết quả đặc trưng cộng hưởng plasmon của các mẫu dung dịch keo AgNP cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại được điều chế ở nhiệt độ 90ºC là cao nhất. Khi tăng lên 100oC thì độ hấp thụ quang của hệ keo AgNP tạo thành

giảm, định hấp thụ cực đại chuyển về phía bước sóng dài chứng tỏ có sự tạo thành AgNP kích thước lớn khi thực hiện phản ứng ở điều kiện này.

Vì vậy, nhiệt độ phản ứng thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP là 90ºC.

Hình 3.7 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của dung dịch keo AgNP được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến kích thước và nồng độ keo AgNP tạo thành cho thấy điều kiện tối ưu để tổng hợp AgNP được xác định như sau:

AgNO3 1mM: 125 ml

Natri citrat (1%wt): 6ml

Nhiệt độ phản ứng: 90ºC

Thời gian phản ứng: 15 phút

3.1.2. Phân tích các đặc trưng của sản phẩm AgNP đã tổng hợp

a. Hình dạng và kích thước của AgNP

Để quan sát được hình dạng và xác định được kích thước của các hạt nano bạc đã được tổng hợp ở điều kiện tối ưu, chúng tôi sử dụng phương pháp chụp ảnh truyền qua TEM.

Kết quả phân tích từ ảnh TEM (Hình 3.8) cho thấy các hạt AgNP tạo thành có hình cầu với kích thước nằm trong khoảng 16 – 18nm, các hạt phân tán khá đều.

Hình 3.8 Ảnh chụp TEM của dung dịch keo nano bạc đã được tổng hợp

b. Cấu trúc tinh thể của hạt keo AgNP

Để xác định cấu trúc tinh thể của keo AgNP đã tổng hợp chúng tôi tiến hành phân tích nhiễu xạ tia X theo mục 2.2.3.

Hình 3.9 Giản đồ nhiễu xạ tia X của dung dịch keo nano bạc đã được tổng hợp

Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X của keo AgNP trình bày ở cho thấy trên giản đồ xuất hiện 3 đỉnh nhiễu xạ có cường độ cao ứng với các giá trị góc 2θ tại 38,14o; 44,49o; 64,57o, 77,21o

. Đây chính là các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng cho các mặt (111), (200), (220), (311) của mạng tinh thể lập phương tâm mặt của Ag. Với những đỉnh nhiễu xạ nhận được trên, ta có thể hoàn toàn khẳng định mẫu sản phẩm đã tổng hợp chính là AgNP.

3.2.ĐIỀU CHẾ CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC 3.2.1. Tối ưu hóa quy trình điều chế WSC 3.2.1. Tối ưu hóa quy trình điều chế WSC

Tiến hành điều chế WSC theo quy trình ở mục 2.3.3, ta thu được kết quả như Hình 3.10.

Hình 3.10 (a) WSC được điều chế ở dạng rắn (b) WSC được hòa tan trong nước

Để điều chế WSC, một trong những yếu tố quan trọng đầu tiên phải nói đến là nồng độ H2O2. Ngoài ra, thời gian khuấy cũng như nhiệt độ phản ứng thích hợp sẽ tạo môi trường thuận lợi để điều chế WSC với hiệu quả cao nhất.

Chúng tôi tiến hành điều chế WSC như sơ đồ ở Hình 2.1 với khoảng nồng độ H2O2 là 4% - 6%, thời gian của phản ứng được duy trì từ 2 - 4 giờ, nhiệt độ được khảo sát 40oC - 60ºC.

Hiệu suất thu WSC sẽ được lập thành bảng, biểu diễn trên đồ thị để đánh giá và rút ra kết luận cuối cùng.

a. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2

Hình 3.11 Các mẫu WSC được điều chế với các nồng độ khác nhau của dung dịch H2O2

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến hiệu suất điều chế WSC

Nồng độ H2O2 (%) H (%) 4 15,8 4,5 21,1 5 12,4 5,5 31,9 6 22,8

Chúng tối tiến hành điều chế, thu nhận WSC và tính hiệu suất theo quy trình mục 2.3.3 với nồng độ H2O2 lần lượt là 4%; 4,5%; 5%; 5,5%; 6%. Kết quả thu được như ở Hình 3.11 và hiệu suất của quá trình được thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.2. Thực nghiệm cho thấy tạo lượng WSC lớn nhất khi nồng độ H2O2 là 5,5%. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn giá trị nồng độ H2O2 là 5,5% để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến hiệu suất quá trình điều chế WSC

b. Ảnh hưởng của thời gian

Chúng tối tiến hành điều chế, thu nhận WSC và tính hiệu suất theo quy trình 2.3.3 với nồng độ H2O2 là 5,5% được lần lượt khuấy trong 2 giờ đến 4 giờ. Kết quả được thể hiện qua Hình 3.13, Hình 3.14 và Bảng 3.2

Hình 3.13 Các mẫu WSC được điều chế với các thời gian khuấy khác nhau

8 13 18 23 28 33 3.5 4.5 5.5 6.5 H(%) Nồng độ H2O2 (%)

Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khuấyđến hiệu suất điều chế WSC

Thời gian (giờ) H (%)

2 21,9

2,5 23,3

3 27,1

3,5 32,5

4 26,1

Nhìn vào đồ thị Hình 3.14 ta thấy thời gian tốt nhất của quá trình điều chế WSC là 3,5 giờ. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian là 3,5 giờ cho những thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian khuấy đến hiệu suất quá

trình điều chế WSC 20.0 22.0 24.0 26.0 28.0 30.0 32.0 34.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 H%

c. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hình 3.15 Các mẫu WSC được điều chế ở các nhiệt độ khác nhau

Tương tự, chúng tối tiến hành điều chế, thu nhận WSC và tính hiệu suất theo quy trình 2.3.3 với nồng độ H2O2 là 5,5% được khuấy liên tục trong 3,5 giờ với các mức nhiệt độ từ 30oC đến 60oC. Kết quả thể hiện ở Hình 3.15, Hình 3.16 và Bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độđến hiệu suất điều chế WSC

Nhiệt độ (ºC) H (%)

30 31,9

40 79,1

50 63,5

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độđến hiệu suất quá trình điều chế WSC

Nhìn vào đồ thị, tại giá trị nhiệt độ là 40ºC, hiệu suất của quá trình điều chế WSC đạt cao nhất.

Như vậy, từ những kết quả trên chúng tôi chọn điều kiện tối ưu để điều chế WSC như sau:

 Nồng độ H2O2: 5,5%

 Thời gian khuấy: 3,5 giờ

 Nhiệt độ của phản ứng: 40ºC

3.2.2. Phân tích các đặc trưng của WSC đã điều chế

a. Phổ hồng ngoại (IR)

Sau khi thực hiện quá trình điều chế WSC ở điều kiện tối ưu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại.

25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 25 35 45 55 65 H (%) Nhiệt độ (ºC)

Hình 3.17 Phổ IR của Chitosan

Kết quả đo IR của Chitosan được thể hiện ở Hình 3.17 cho thấy trên phổ đồ xuất hiện các pic tại 3440,32 cm-1 đặc trưng cho nhóm -OH. Bên cạnh đó, còn có các dao động ở 2919,28 cm-1 của liên kết (-CH2); ở 1653,14 cm-1 của liên kết (N-H); ở 1081,4 cm-1 của liên kết (C=O).

Kết quả đo IR của WSC được điều chế ở điều kiện tối ưu thể hiện ở Hình 3.18. Nhìn vào phổ đồ, ta thấy xuất hiện các pic đặc trưng cho các nhóm chức và liên kết của WSC tương tự phổ đồ của Chitosan: Dao động ở 3416,91 cm-1 đặc trưng cho nhóm -OH; ở 2923,53 cm-1 của liên kết (-CH2); ở 1637,81 cm-1 của liên kết (N-H) và ở 1081,68 cm-1 của liên kết (C=O).

So sánh phổ IR của Chitosan và WSC, ta thấy rằng trên cả hai phổ đồ đều xuất hiện pic đặc trưng cho nhóm chức -OH, liên kết (C=O), liên kết (N- H) và liên kết (-CH2) (Hình 3.19)

Vậy khi thực hiện quá trình cắt mạch Chitosan để tạo WSC chỉ làm thay đổi khối lượng phân tử của Chitosan mà không làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc đặc trưng của Chitosan.

Hình 3.19 Phổ IR của Chitosan(1), WSC điều chế(2)

b. Phương pháp đo độ nhớt

Sau khi thực hiện quá trình điều chế WSC ở điều kiện tối ưu, chúng tôi tiến hành đo độ nhớt của Chitosan và WSC đã điều chế với cùng các thông số thí nghiệm như Bảng 3.4 để so sánh khối lượng phân tử của chúng. Trong đó

dung môi sử dụng là axit axetic nồng độ 5%, mẫu 1 chứa Chitosan, mẫu 2 chứa WSC.

Bảng 3.4 Các thông số của phương pháp đo độ nhớt

Mẫu Khối lượng chất tan

(g) Thể tích dung môi (ml) Nhiệt độ (oC) 1 0,1 50 40 2 0,1 50 40

Kết quả thu được: Độ nhớt động học ở 40oC của Chitosan là 0,924 (mm2/s) và của WSC là 0.801 (mm2/s). Điều đó chứng tỏ phân tử khối của WSC nhỏ hơn so với Chitosan, nghĩa là đã xảy ra sự phân cắt mạch trong quá trình điều chế WSC từ Chitosan.

3.3.TẠO VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN AgNP – CURCUMIN – CHITOSAN CÓ KHẢ NĂNG TRỊ BỎNG

3.3.1. Tạo vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan

Hình 3.20 Vật liệu kháng khuẩn AgNP – Curcumin – Chitosan

Chúng tôi tiến hành tạo vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan theo mục 2.5.1. Sản phẩm thu được có màu nâu vàng, hơi sệt, khi bôi lên da hình thành một lớp màng dễ bám dính, mịn màng (Hình 3.20). Vật liệu tổ hợp

AgNP – Curcumin – Chitosan được giữ trong lọ kín, bảo quản trong tủ lạnh nhằm tránh sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm mốc.

3.3.2. Xác định thành phần của vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan

Sau khi tạo vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan theo mục 2.5.1 chúng tôi xác định thành phần của vật liệu tổ hợp trên bằng cách tiến hành đo phổ tán xạ năng lượng tia X. Kết quả thu được trình bày ở Hình 3.21 cho thấy có xuất hiện thêm các đỉnh pic có giá trị 2,983 keV tương ứng với kim loại bạc ngoài các nguyên tố có hàm lượng lớn như C, O ở trong Curcumin và Chitosan. Từ các kết quả đo phổ EDX, ta thấy hàm lượng các nguyên tố không thay đổi đáng kể. Điều này chứng tỏ vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan khá đồng nhất.

Hình 3.21 Phổ EDX của vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 keV 002 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 Coun ts CKa OKa Mg Ka AlKa SiKa PKa ClKesc ClKa ClKb KKa KKb CaKesc CaKa CaKb FeLl FeLa

FeKesc FeKa FeKb

CuLl CuLa CuKa CuKb AgLa AgLb AgLb 2

Tỉ lệ thành phần cụ thể các nguyên tố vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan được thể hiện chi tiết ở Bảng 3.5

Bảng 3.5 Thành phần định lượng các nguyên tố trong vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan

3.3.3. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan

Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng khuẩn theo mục 2.5.3, đối với vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin với hai chủng vi khuẩn: Gram (-) E.coli và Gram (+) Staphylococcus aureus (khuẩn tụ cầu vàng). Kết quả ức chế vi khuẩn ở Hình 3.22 và Hình 3.23 cho thấy khả năng kháng khuẩn của AgNP nhỏ hơn của vật liệu tổ hợp AgNP – Curcumin – Chitosan. Dung dịch keo AgNP có khả năng kháng khá tốt đối với vi khuẩn Gram (-) E. coli ứng với đường kính vòng ức chế là 10 mm và vi khuẩn Gram (+)