5. Cấu trúc luận văn
2.4. PHÂN TÍCH ĐẶC TRƯNG CỦA WSC ĐÃ TỔNG HỢP
2.4.1. Phổ hồng ngoại
Cấu trúc của WSC được tạo ra từ chitosan được xác định bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) trong vùng từ 400 4000 cm-1. Vùng này sẽ cho ta
1.Trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% 2. Lọc bỏ kết tủa
3. Thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
1. Sấy qua đêm ở 50ºC
2. Lọc lấy kết tủa, sấy ở nhiệt độ phòng
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
Chitosan
Dung dịch Chitosan
Chitosan được phân cắt mạch
WSC
1. Dung dịch CH3COOH 2%
2. Khuấy
1. Dung dịch H2O2 (4-6%)
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
2. Khuấy
Dung dịch chứa Chitosan hòa tan
những thông tin quan trọng về dao động của các phân tử, đó là thông tin về cấu trúc của phân tử. Chất nghiên cứu (2-5mg) được nghiền nhỏ, trộn với bột KBr khan rồi ép thành tấm mỏng. Đặt tấm mỏng vào cuvet để ghi phổ. Dựa vào phổ, cho phép khẳng định sự có mặt của các nhóm chức trong WSC.
2.4.2. Phương pháp đo độ nhớt
a. Độ nhớt động học
Thời gian chảy đo được của một thể tích chất lỏng không đổi dưới tác dụng của trọng lực chảy qua mao quản của nhớt kế đã hiệu chuẩn ở nhiệt độ cho trước được kiểm soát. Độ nhớt động học là tích của thời gian chảy đo được và hằng số hiệu chuẩn nhớt kế.
Hình 2.2 Cấu tạo của nhớt kế ống mao quản
b. Cách tiến hành
Nạp mẫu vào nhớt kế theo thiết kế của thiết bị đã hiệu chuẩn.
Để nhớt kế đã nạp mẫu trong bể giữ nhiệt để đạt đến nhiệt độ thí nghiệm trong khoảng thời gian 30 phút để cân bằng nhiệt độ.
Điều chỉnh mẫu thử đến vị trí trong nhánh mao quản cao hơn vạch mức đo thời gian thứ nhất khoảng 7 mm. Để mẫu chảy tự do, đo thời gian của mặt
khum chất lỏng chảy từ vạch dấu thứ nhất đến vạch dấu thứ 2, thời gian tính bằng giây, sai số đến 0,1 giây.
c. Mối liên hệ giữa độ nhớt và khối lượng phân tử trung bình
Độ nhớt và phân tử khối trung bình của polyme có mối liên hệ theo hệ thức Mark – Houwink
K M. Trong đó:
: Độ nhớt của polyme
M : Phân tử khối trung bình của polyme (g/mol)
K, α: Những hằng số phụ thuộc vào bản chất polyme và dung môi
Như vậy, từ hệ thức trên ta thấy rằng, những polyme có phân tử khối trung bình càng lớn thì độ nhớt càng cao và ngược lại. Nói cách khác, độ nhớt của WSC sẽ nhỏ hơn độ nhớt của Chitosan.
2.5.CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU TỔ HỢP CHITOSAN – AgNP– CURCUMIN VẬT LIỆU TỔ HỢP CHITOSAN – AgNP– CURCUMIN
2.5.1. Chế tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
Chúng tôi tiến hành phối trộn AgNP, WSC và Curcumin để tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin theo sơ đồ Hình 2.3.
Đầu tiên, cân 1 gam curcumin hòa tan vào 1ml cồn tuyệt đối, khuấy trộn đều tạo thành dung dịch lỏng sệt.
Thêm 2 gam WSC đã điều chế vào hỗn hợp trên, tiếp theo cho thêm vào 3ml dung dịch nano bạc đã tổng hợp rồi khuấy trộn kĩ để tạo hỗn hợp đồng nhất.
Đóng kín và bảo quản hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin ở điều kiện thích hợp cho đến khi sử dụng.
Hình 2.3 Sơ đồ tạo vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
2.5.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin Chitosan – AgNP – Curcumin
Kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tương tác với các bức xạ (mà chủ yếu là chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử). Vì vậy, thành phần hóa học của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được xác định dựa vào việc ghi lại phổ tán xạ năng lượng tia X.
2.5.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
Tính kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin được đánh giá thông qua khả năng ức chế của nó đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) bằng phương pháp khuếch tán đĩa trên môi trường nuôi cấy agarose.
Curcumin
Hỗn hợp lỏng sệt
Vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
1. Dung dịch cồn tuyệt đối 2. Khuấy trộn
1. WSC
2. dung dịch nano bạc 3. Khuấy trộn
a. Chuẩn bị môi trường cấy
Thạch Mueller-Hinton
Sử dụng thạch Mueller – Hinton để làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton theo các bước như sau:
Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.
Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần. Nếu pH nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác.
Hấp tiệt trùng môi trường thạch ở 121oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50°C.
Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch). Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng. Không đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm vì nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng khuẩn giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.
Khoanh giấy kháng sinh
Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường. Các khoanh giấy kháng sinh được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo.
Nước muối sinh lý NaCl 0.9%
Nước muối sinh lý NaCl 0.9% có pH = 7, sấy khử trùng 121°C trong 15 phút và được bảo quản trong chai vặn kín, để ở nhiệt độ phòng.
b. Quy trình thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin
Thuyết minh sơ đồ Hình 2.4 :
(1)Chủng vi khuẩn gốc
Hai chủng vi khuẩn gốc Escherichia coli (E. Coli) và Staphylococcus aureus (S. aure) được cung cấp từ Khoa Vi sinh, Bệnh viện Đà Nẵng trong môi trường nuôi cấy thạch nghiêng.
(2)Khuẩn lạc đơn
Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trước 1 ngày được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế và ủ các đĩa thạch ở 37°C trong vòng 24 giờ trong tủ ấm để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
(3)Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí
Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý NaCl 0.9 % vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.
(4) Cấy trải vi khuẩn lên đĩa thạch
Sử dụng ngay huyền dịch đã chuẩn bị láng đều lên mặt thạch Mueller- Hinton chứa trong đĩa petri và hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.
Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
Hình 2.4 Sơ đồ thực hiện phương pháp khuếch tán đĩa để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu tổ hợp Chitosan – AgNP – Curcumin
(5) Đặt khoanh giấy kháng sinh
Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt (trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch).
Chuẩn vi khuẩn gốc
Khuẩn lạc đơn
Huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch
Mueller-Hinton Đặt khoanh giấy kháng sinh Đo vòng kháng khuẩn Phân tích kết quả (1) (2) (3) (4) (5) (6) (6) (7)
Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch. Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
Dùng micropipet nhỏ lần lượt mỗi 10 µl dung dịch nano bạc đã điều chế cũng như vật liệu tổ hợp AgNP – Chitosan – Curcumin lên mỗi khoanh giấy. Sau đó để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các dung dịch từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Đậy nắp đĩa thạch và ủ ấm ở 37°C trong vòng 24 giờ.
(6) Đo vòng kháng khuẩn
Lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước kẻ đến đơn vị milimet.
(7) Phân tích kết quả
Dựa vào sự xuất hiện vòng kháng khuẩn để đánh giá các dung dịch có kháng khuẩn hay không đối với mỗi chủng vi khuẩn thử. Nếu xuất hiện vòng kháng khuẩn bao quanh khoanh giấy kháng sinh chứng tỏ dung dịch được tẩm lên khoanh giấy có khả năng kháng khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.
2.5.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng trị bỏng
Để đánh giá khả năng trị bỏng của hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên thỏ:
Thỏ trưởng thành được cạo lông dọc 2 bên lưng
Dùng miếng thép tiết diện 1x1cm2, đốt nóng trên bếp gas trong 2 phút, sau đó gây bỏng 4 vết như nhau trên vùng cạo lông, rồi đánh dấu các vết bỏng theo thứ tự (1), (2), (3), (4).
+ Vết thứ 1: Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên.
+ Vết thứ 2: Sử dụng WSC được hòa tan trong nước bôi lên vết thương bỏng.
+ Vết thứ 3: Sử dụng hỗn hợp vật liệu WSC – AgNP bôi lên vết thương bỏng.
+ Vết thứ 4: Sử dụng hỗn hợp vật liệu Chitosan – AgNP – Curcumin đã phối trộn ở trên bôi lên vết thương bỏng.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.TỔNG HỢP NANO BẠC
3.1.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho quy trình tổng hợp AgNP
Tiến hành tổng hợp AgNP theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.1.3, ta thấy dung dịch phản ứng chuyển từ không màu sang vàng sẫm (Hình 3.1) chứng tỏ có sự tạo thành dung dịch keo AgNP.
Hình 3.1 Nano bạc đã được tổng hợp
Quá trình điều chế AgNP bằng phản ứng hoá học đi từ phản ứng oxi hoá khử chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố, gồm: nồng độ chất khử, thời gian, nhiệt độ, pH. Kết quả khảo sát từ các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình khử Ag+ để tạo AgNP đạt hiệu quả cao tại môi trường pH trung tính.
Mặc khác, trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở ngưỡng nhiệt độ từ 70ºC đến 100ºC màu sắc của hỗn hợp phản ứng có sự thay đổi từ không màu sang vàng nhạt, vàng đậm đến vàng nâu.
a. Ảnh hưởng của thể tích Natri citrat
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích chất khử đến kích thước cũng như nồng độ của dung dịch keo AgNP tạo thành. Quá trình tổng hợp nano bạc được tiến hành theo quy trình ở mục 2.1.3 với những thể tích Natri citrat 1% khác nhau (4ml; 5ml; 6ml; 7ml; 8ml). Phản ứng được tiến hành ở 90oC trong vòng 15 phút. Mẫu của các dung dịch keo nano bạc đã tổng hợp được trình bày ở Hình 3.2. Kết quả đo quang phổ hấp thụ UV – Vis được trình bày ở Hình 3.3.
Theo thuyết Mie, đỉnh hấp thụ cực đại của hạt nano sẽ chuyển về vùng có bước sóng lớn khi kích thước hạt tăng lên, nồng độ hạt keo nano càng cao thì độ hấp thụ quang càng lớn [10].
Hình 3.3 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của AgNP được tổng hợp ở các thể tích khác nhau của Natri citrat
Từ đồ thị ở Hình 3.3 cho thấy trong khoảng thể tích Natri citrat từ 4 ÷ 8 ml, đỉnh hấp thụ cực đại phổ plasmon bề mặt của AgNP gần như không có sự thay đổi. Tuy nhiên, độ hấp thụ cực đại cao nhất khi thể tích Natri citrat là 6 ml. Vì thế, thể tích Natri citrat (1%wt) được lựa chọn để tổng hợp dung dịch keo AgNP là 6ml.
b. Ảnh hưởng của thời gian
Bên cạnh thể tích chất khử, thời gian cũng đóng vai trò quyết định đến kích thước của AgNP tạo thành. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tổng hợp AgNP. Thí nghiệm được tiến hành như mục 2.1.3 với những thời gian khác nhau (5; 10; 15; 20 phút). Tỉ lệ các chất trong hỗn hợp là 125ml AgNO3 1mM và 6ml Natri citrat (1%wt), phản ứng được tiến hành ở 90oC và tốc độ khuấy được giữ không đổi. Sự thay đổi màu của hỗn hợp phản ứng và tín hiệu cộng hưởng plasmon bề mặt của các mẫu dung dịch keo nano bạc ở các thời gian khác nhau được thể hiện ở Hình 3.4 và Hình 3.5.
Hình 3.4 Màu sắc sản phẩm AgNP được tổng hợp ở những thời gian khác nhau
Hình 3.5 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của dung dịch keo AgNP được tổng hợp ở những thời gian khác nhau
Kết quả thể hiện ở Hình 3.5 cho thấy hàm lượng AgNP tăng dần theo thời gian phản ứng từ phút thứ 5 đến phút thứ 15, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ không màu sang vàng sẫm và đậm dần. Sau 15 phút và 20 phút kể từ lúc cho chất khử vào, đỉnh hấp thụ cực đại của AgNP cao nhất. Tuy nhiên,
cường độ hấp thụ tại khoảng thời gian 15 phút là lớn nhất nên thời gian phản ứng thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP là 15 phút.
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sau khi chọn được thể tích và thời gian tối ưu để tổng hợp AgNP, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến kích thước hạt AgNP tạo thành. Quá trình tổng hợp nano bạc được tiến hành như mục 2.1.3 với các nhiệt độ khác nhau (70oC; 80oC; 90oC; 100oC). Thể tích AgNO3 1mM là 125ml và Natri citrat 1% là 6ml được giữ không đổi. Phản ứng được tiến hành ở 90oC trong vòng 15 phút.
Hình 3.6 Màu sắc sản phẩm AgNP được tổng hợp ở những nhiệt độ khác nhau
Màu của dung dịch keo AgNP tạo thành ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày ở Hình 3.6 và kết quả đo phổ cộng hưởng plasmon bề mặt được trình bày ở Hình 3.7.
Kết quả đặc trưng cộng hưởng plasmon của các mẫu dung dịch keo AgNP cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại được điều chế ở nhiệt độ 90ºC là cao nhất. Khi tăng lên 100oC thì độ hấp thụ quang của hệ keo AgNP tạo thành
giảm, định hấp thụ cực đại chuyển về phía bước sóng dài chứng tỏ có sự tạo thành AgNP kích thước lớn khi thực hiện phản ứng ở điều kiện này.
Vì vậy, nhiệt độ phản ứng thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp dung dịch keo AgNP là 90ºC.
Hình 3.7 Đặc trưng cộng hưởng plasmon của dung dịch keo AgNP được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến kích thước và nồng độ keo AgNP tạo thành cho thấy điều kiện tối ưu để tổng hợp AgNP được xác định như sau:
AgNO3 1mM: 125 ml
Natri citrat (1%wt): 6ml
Nhiệt độ phản ứng: 90ºC
Thời gian phản ứng: 15 phút
3.1.2. Phân tích các đặc trưng của sản phẩm AgNP đã tổng hợp
a. Hình dạng và kích thước của AgNP
Để quan sát được hình dạng và xác định được kích thước của các hạt nano bạc đã được tổng hợp ở điều kiện tối ưu, chúng tôi sử dụng phương pháp chụp ảnh truyền qua TEM.
Kết quả phân tích từ ảnh TEM (Hình 3.8) cho thấy các hạt AgNP tạo thành có hình cầu với kích thước nằm trong khoảng 16 – 18nm, các hạt phân tán khá đều.
Hình 3.8 Ảnh chụp TEM của dung dịch keo nano bạc đã được tổng hợp
b. Cấu trúc tinh thể của hạt keo AgNP
Để xác định cấu trúc tinh thể của keo AgNP đã tổng hợp chúng tôi tiến hành phân tích nhiễu xạ tia X theo mục 2.2.3.
Hình 3.9 Giản đồ nhiễu xạ tia X của dung dịch keo nano bạc