Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (viết tắc là GC – MS hoặc GCMS) dựa trên cơ sở nối ghép máy sắc ký khí (gas chromatography) và khối phổ (mass spectrometry). GC – MS là một phương pháp mạnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí.
Nguyên lý hoạt động của máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa tiêm mẫu. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium, nhiệt độ ở cửa
tiêm mẫu sẽ được nâng lên 30000C để mẫu trở thành dạng khí. Phần vỏ ngoài
(oven) của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao
22
chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polimer đặc biệt. Các chất có trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ, ở đây chúng bị ion hóa, sau đó sẽ tới bộ phận lọc (detector). Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định.
Thiết bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối. Phổ khối là một phổ đồ phản ảnh các ion với khối lượng khác nhau đi qua bộ phận lọc. Máy tính là bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa kết quả khối phổ.
So sánh kết quả khối phổ thu được trong thí nghiệm với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác định trước. Nếu tìm được chất tương ứng trong thư viện thì có thể định danh được chất đó. Nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng thì ta thu được một dữ liệu mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này.
23
CHƯƠNG 2
NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu
Qủa sung sau các bước xử lý.
Hình 2.1. Quả sung tươi Hình 2.2. Sug phơi khô Hình 2. 3. Sung nghiền mịn
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất a. Dụng cụ
Thiết bị sử dụng trong quá trình chiết:
- Máy đo Quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, Máy sắc ký khí khối phổ
GC-MS, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, bộ chiết Soxhlet 250ml, bếp cách thủy, bình định mức, ống đong, cốc sứ, bình tam giác có nút nhám, các loại pipet, bình định mức, phễu lọc.
b. Hóa chất
Dưới đây là danh sách một số hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Hóa chất được sử dụng trong quá trình chiết
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 N - hexan Trung Quốc
2 Etylaxetat Trung Quốc
3
24
2.2. NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA QUẢ SUNG
2.2.1. Khảo sát nguyên liệu a. Thu gom nguyên liệu a. Thu gom nguyên liệu
Quả sung dùng làm nguyên liệu được thu hái tại xã Đại Quang, tỉnh Quảng Nam.
b. Xử lý nguyên liệu
Quả sung được thu hái lúc chưa chín, loại bỏ những quả không đạt chất lượng (quả chín, quả hư, quả non), rửa sạch, trải đều và phơi trong điều kiện nắng to trong ba ngày. Sau khi quả khô, đem xay thành bột và bảo quản trong bình kín.
2.2.2. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý a. Độ ẩm a. Độ ẩm
Mục tiêu
Dược liệu (thực vật) thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì nguyên liệu dễ bị mốc, hư hỏng. Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho nguyên liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản. Một số được liệu cụ thể có thể có độ ẩm an toàn hay độ ẩm cho phép cao hơn hay thấp hơn [1].
Cách tiến hành
Chuẩn bị 5 chén sứ có kí hiệu sẵn các mẫu, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy. Sau khi sấy xong lấy ra bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng của các chén sứ đến khối lượng không đổi.
Lấy vào mỗi chén 5g bột quả sung khô theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén
sứ. Tiến hành sấy trên tủ sấy ở nhiệt độ 1050C, sau 5h lấy ra cân.
Độ ẩm của mỗi chén là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân.
Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Cách tính độ ẩm
Độ ẩm của mỗi mẫu được tính theo công thức sau:
W(%) =
m2 m3
x100 % (2.1)
25 Độ ẩm trung bình được tính theo công thức sau:
WTB(%)= (2.2) Trong đó
m1 : Khối lượng mẫu (g)
m2 : Khối lượng chén và mẫu chưa sấp (g)
m3 : Khối lượng chén và mẫu sau sấy (g)
W(%) : Độ ẩm của mỗi mẫu
WTB(%) : Độ ẩm trung bình
b. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu Mục tiêu
Xác định hàm lượng tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu. Đây là thành phần các chất vô cơ của dược liệu nhưng cũng có thêm những tạp chất vô cơ (như đất, cát,…) lẫn vào dược liệu. Các loại cây khác nhau, sinh trưởng ở những vùng khác nhau nên sẽ có thành phần vô cơ khác nhau [1].
Cách tiến hành
Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong nụ vối ta dùng phương pháp tro hóa mẫu.
Chuẩn bị 5 chén sứ có kí hiệu sẵn các mẫu, các chén sứ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy. Sau khi sấy xong lấy ra bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng của các chén sứ đến khối lượng không đổi.
Lấy vào mỗi chén 2g bột quả sung khô theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén
sứ. Tiến hành nung ở 5000C trong chén sứ, các chất hữu chơ bị đốt cháy, trong tro
còn lại các chất vô cơ khó bay hơi.
Khối lượng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung.
Tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 5000C trong thời gian 8 – 12h, cho đến
khi thu được tro trắng (Hình 2.4).
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi.
Cách tính hàm lượng tro:
A(%)= ×100% (2.3)
26
ATB(%)= (2.4)Trong đó
m0 : Khối lượng chén sứ (g)
m1 : Khối lượng mẫu (g)
m3 : Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa mẫu (g)
Hình 2.4. Mẫu xác định hàm lượng tro
Xác định hàm lượng một số kim loại nặng trong quả sung bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS
Mục tiêu
Tùy theo điều kiện thổ nhưỡng mà hàm lượng các kim loại nặng trong cây có thể thay đổi. Ở những vùng đất bị ô nhiễm, các dược liệu có thể có một lượng kim loại nặng rất cao có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng.
Cách tiến hành
Tro thu được sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức
bằng nước cất và xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
Cơ sở của phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS
Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là một kỹ thuật phân tích tương đối mới đã và đang được phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học – kỹ thuật ở các nước phát triển. Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lượng ánh sáng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thụ theo định luật hấp thụ ánh sáng Lambert – Beer.
27
Mẫu được nguyên tử hóa bằng phương pháp ngọn lửa, với hỗn hợp khí đốt là C2H2
– không khí. Định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn.
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
xử lý nguyên liệu
Xay mịn
1.Dm n- Hexan 1. Dm EA 1. Dm Diclometan 2. Khảo sát thời gian chiết 2. Khảo sát thời gian chiết 2. Khảo sát thời gian chiết
gian chiết
Định danh GC-MS
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm
2.4. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT BỘT QUẢ SUNG BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU DUNG MÔI KHÁC NHAU
2.4.1. Khảo sát điều kiện chiết bột quả sung bằng dung môi n – hexan
Mẫu quả sung sau khi
xử lý
Xác định các chỉ tiêu hóa lý
Bột quả sung khô
Mẫu quả sung Dịch chiết Hexan Bã Hexan Bã Dicho metan Dịch Chiết Dichom etan Bã EA Dịch Chiết EA Thành phần định danh trong các dịch chiết
28
Cách tiến hành
Lấy 5 mẫu bột quả sung khô, mỗi mẫu có khối lượng 10g (mo). Tiến hành
chiết soxhlet với 150ml dung môi n – hexan (khối lượng riêng D = 0,638 g/ml) trong các khoảng thời gian là 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đối với mỗi mẫu đo thể tích V (ml) dịch chiết thu được. Dùng pipet bầu lấy chính xác 10ml dịch chiết
của mỗi mẫu cho vào cốc đã biết chính xác khối lượng (mc(g)). Cân cốc đã chứa
mẫu (ms(g)) và tính khối lượng m (g) của 10ml dịch chiết, từ đó suy ra khối
lượng riêng d (g/ml) của mỗi mẫu dịch chiết (Hình 2.6). Khối lượng sản phẩm chiết được tính như sau:
d = m/10 (g/ml) (2.5) m’ = d.V – D.V (g) (2.6) Trong đó:
m’: Khối lượng chất chiết ra được từ 10g nguyên liệu (g) D: Khối lượng riêng của dung môi nguyên chất (g/ml)
Hình 2.6. Dịch chiết quả sung bằng dung môi n – hexan
2.4.2. Khảo sát điều kiện chiết bột quả sung bằng dung môi etylaxetat
Cách tiến hành
Lấy 5 mẫu bột quả sung khô, mỗi mẫu có khối lượng 10g (mo). Tiến hành chiết
soxhlet với 150ml dung môi etylaxetat (khối lượng riêng D = 0,871 g/ml) trong các khoảng thời gian là 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đối với mỗi mẫu đo thể tích V (ml)
Dịch chiết thu được. Dùng pipet bầu lấy chính xác 10ml dịch chiết của mỗi mẫu
cho vào cốc đã biết chính xác khối lượng (mc(g)). Cân cốc đã chứa mẫu (ms(g)) và
tính khối lượng m (g) của 10ml dịch chiết, từ đó suy ra khối lượng riêng d (g/ml) của mỗi mẫu dịch chiết (Hình 2.7)
29
Khối lượng sản phẩm chiết được tính theo công thức 2.5 và 2.6.
Hình 2.7. Dịch chiết quả sung bằng dung môi etylaxetat
2.4.3. Khảo sát điều kiện chiết bột quả sung bằng dung môi diclometan
Cách tiến hành
Lấy 5 mẫu bột quả sung khô, mỗi mẫu có khối lượng 10g (mo). Tiến hành
chiết soxhlet với 150ml dung môi diclometan (khối lượng riêng D = 1,282 g/ml) trong các khoảng thời gian là 4h, 6h, 8h, 10h và 12h. Đối với mỗi mẫu đo thể tích V (ml) dịch chiết thu được. Dùng pipet bầu lấy chính xác 10ml dịch chiết
của mỗi mẫu cho vào cốc đã biết chính xác khối lượng (mc(g)). Cân cốc đã chứa
mẫu (ms(g)) và tính khối lượng m (g) của 10ml dịch chiết, từ đó suy ra khối
lượng riêng d (g/ml) của mỗi mẫu dịch chiết (Hình 2.5).
Khối lượng sản phẩm chiết được tính theo công thức 2.5 và 2.6.
30
2.5. CHIẾT TÁCH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA DỊCH CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU TỪ BỘT QUẢ SUNG CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU TỪ BỘT QUẢ SUNG
Cách tiến hành
Tiến hành chiết soxhlet 10g bột quả sung, ở thời gian tối ưu cho mỗi loại dung môi tương ứng là n – hexan, etylaxetat, diclometan, methanol; nhiệt độ chiết ứng với nhiệt độ sôi của mỗi dung môi. Thư được các dịch chiết tương ứng trong 4 bình tam giác có ký hiệu sẵn. Làm bay hơi dung môi ta được các cao chiết tương ứng. Các loại cao chiết này đươc đem đi phân tích GC – MS tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II, số 2 – Ngô Quyền – Đà Nẵng.
31
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ
3.1.1. Độ ẩm
Mẫu quả sung khô được tiến hành xác định độ ẩm. Số lượng mẫu là 5. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
Kết quả xát định độ ẩm trung bình của mẫu quả sung khô được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm STT mo(g) m1(g) m2(g) m3(g) m(g) W(%) WTB (%) 1 10.342 1.808 12.876 13.041 0.165 9.156 9.16 2 10.456 1.809 13.466 13.630 0.164 9.099 3 10.398 1.808 13.245 13.411 0.116 9.234 Nhận xét:
Theo cách xử lý như mục 2.2.2 độ ẩm trung bình của quả sung khô là 9.16% và nằm trong khoảng độ ẩm cho phép. Với độ ẩm này có thể bảo quả mẫu tốt ở nơi khô thoáng, tránh sự xâm hại của vi sinh vật và nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Mẫu quả sung khô được tiến hành xác định hàm lượng tro. Số lượng mẫu là 5. Hàm lượng tro là hàm lượng trung bình của 5 mẫu.
Kết quả xát định hàm lượng tro trung bình của mẫu quả sung khô được trình bày ở
bảng Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro
STT mo(g) m1(g) m2(g) m3(g) m4(g) A(%) ATB(%) 1 10.342 1.808 12.876 10.418 0.076 4.230 4.320 2 10.456 1.809 13.466 10.537 0.081 4.509 3 10.398 1.808 13.245 10.474 0.076 4.221 Nhận xét:
Hàm lượng tro trung bình của quả sung khô là 4.320%. Có thể thấy hàm lượng
32
tro khá lớn. Vì vậy có thể dự đoán, hàm lượng chất vô cơ trong mẫu quả sung khô tương đối nhiều.
3.1.3 Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử AAS hấp thu nguyên tử AAS
Mẫu sau khi tro hóa được hòa tan bằng dd HNO3 loãng rồi định mức trong
bình định mức 100ml.
Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng được trình bày tại Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại nặng
Kim loại Hàm lượng (mg/l) Hàm lượng hàm lượng cho phép (mg/kg) STT mg/l (mg/kg) 1 As 0.00137 0.90728 1.00000 2 Pb 0.00069 0.45695 2.00000 3 Cu 0.01583 10.4834 30.0000 4 Zn 0.01881 12.4570 40.0000 5 Hg không phát hiện 0.0500 Nhận xét:
Căn cứ quyết định của Bộ Y tế số 46/2007/QD – BYT ngày 19 – 12- 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm với với hàm lượng các kim loại nặng cho phép trong thực phẩm (rau, quả, chè và các sản phẩm chè), cho thấy hàm lượng trong kim loại trong
quả sung như ở Bảng 3.3 là hàm lượng cho phép sử dụng, an toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
3.1.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết bằng các dung môi khác nhau
a. Dung môi n-Hexan
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi n – hexan được trình bày ở Bảng 3.4 .
33
Bảng 3.4. Khảo sát thời gian chiết bằng dung môi n-Hexan
T(h) mo(g) mc(g) ms(g) V(ml) V(ml) d(g/ml m'(g) %mchiết 4 10.003 0.828 7.213 149.400 6.385 0.639 0.1494 1.494 6 10.003 0.817 7.214 147.500 6.397 0.640 0.2950 2.949 8 10.002 0.849 7.280 145.500 6.431 0.643 0.7275 7.273 10 10.002 0.852 7.293 145.200 6.441 0.644 0.8712 8.710 12 10.003 0.852 7.292 143.700 6.440 0.644 0.8622 8.622 Nhận xét:
Từ kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 4 giờ lên 10 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết tăng lên nhưng khi tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết giảm. Điều này có thể giải thích là do ban đầu khi được gia nhiệt khả năng hòa tan của các chất trong nguyên liệu vào dung môi lớn nên khối lượng chất chiết ra tăng lên. Sau một thời gian, các chất có trong nguyên liệu không thể tan vào dung môi thêm được nữa, khi đó quá trình hòa tan kém dần và quá trình bay hơi tang lên nên khối lượng sản phẩm chiết giảm. Hơn nữa, những chất tan được trong dung môi n – hexan là những chất kém phân cực, dễ bay hơi nên khi đun càng lâu thì lượng chất tiết ra càng hao hụt dần. Vì vậy, đối với dung môi n – hexan, thời gia chiết tốt nhất là 10 giờ, tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết là 8.710%.
b. Dung môi etylaxetat
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi etylaxetat được trình bày ở Bảng 3.5
Bảng 3.5. Khảo sát thời gian chiết bằng dung môi etylacetat
T(h) mo(g) mc(g) ms(g) V(ml) m(g) d(g/ml) m'(g) %mchiết 4 10.002 0.843 9.563 148.300 8.720 0.872 0.1483 1.482 6 10.001 0.842 9.591 146.200 8.749 0.875 0.585 5.847