6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN
1.3.4. Phƣơng pháp xác định thành phần nhóm chức trong cao chiết bằng
bằng thuốc thử đặc trƣng
Các nhóm chất trong tổng cao ethanol và các phân đoạn cao tách từ tổng cao ethanol của mẫu thực vật đƣợc định tính bằng các thuốc thử hóa học theo sơ đồ sau:
1.3.5. Phƣơng pháp sắc ký
a. Sắc ký bản mỏng
Phƣơng pháp này đƣợc Izmailop và Schreiber đề nghị từ năm 1938, đƣợc Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955 và có ứng dụng rộng rãi [14], [19].
Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng đƣợc dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc. Sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, đƣợc trải thành lớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu đƣợc một sắc ký đồ trên bản mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
Ðại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/ b (Rf ch có giá trị từ 0 đến 1)
Trong đó: a- Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu. b - Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo
trên cùng đƣờng đi của vết, tính bằng cm.
Sắc ký bản mỏng có ƣu điểm quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong thời gia ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau vì tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể đƣợc định vị trên tấm sắc ký bản mỏng.
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký bản mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các
hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly. Muốn thay đổi khả năng phân tách, ta cần thay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly. Để làm điều này ta chuẩn bị nhiều bản mỏng, chấm mẫu chất lên mỗi bản, mỗi bản giải ly với một hoặc một hệ dung môi khác nhau. Sự lựa chọn dung môi tốt nhất trên một mẫu cụ thể tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân và do kết quả thực nghiệm quyết định. Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi nhiều hơn 2 cấu tử, vì hỗn hợp nhƣ vậy dễ dàng dẫn đến sự thay đổi pha khi có sự chênh lệch nhiệt độ.
Khi lựa chọn đƣợc hệ dung môi giải ly phù hợp, các vết rải đều ra trên bản mỏng với màu sắc và độ đậm nhạt khác nhau. Nhìn màu sắc, độ đậm nhạt, giá trị của Rf của các vết chất ta có thể đoán biết sơ bộ trong mẫu nghiên cứu có các loại hợp chất nào, nhiều hay ít, đâu là các tạp chất.
Sắc ký bản mỏng là phƣơng pháp định tính và có độ phân giải thấp, nếu sau khi giải ly, quan sát thấy một vết trên bản mỏng không có nghĩa ch là một chất mà có thể là hai hay vài chất tụ lại với nhau. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là loại sắc ký với độ phân giải cao sẽ giúp kết luận số lƣợng hợp chất có trong mẫu chính xác hơn. Tuy nhiên với phƣơng pháp HPLC thì những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và dài, ta sẽ không phân biệt đƣợc đó là một mũi (ch sự hiện diện của 1 chất) hay ch là tạp bẩn.
Đối với mẫu chất có nhiều hợp chất có Rf gần sát với nhau, ta dùng kỹ thuật giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản mỏng ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.
Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất, tốt nhất là sử dụng HPLC (cho kết quả độ tinh khiết là bao nhiêu phần trăm), tuy nhiên phƣơng pháp này khá tốn kém nên có thể dùng SKBM. Chuẩn bị ba bản mỏng giống nhau, chấm một lƣợng mẫu nhƣ nhau lên từng bản mỏng. Thực hiện giải ly, mỗi bản với một hệ dung môi khác hẳn nhau (không phải là một hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau). Ba hệ dung môi lựa chọn sao cho vết chất di chuyển và xuất hiện ở khoảng đầu (gần mức xuất phát), khoảng giữa và khoảng cuối bản (gần mức tiền tuyến). Nếu cả ba bản ch có một vết tròn, gọn là mẫu tinh khiết, việc có thêm bất kỳ vết nào khác là còn chƣa
tinh khiết, cần tinh chế thêm. Một hợp chất tinh khiết chỉ có duy nhất một vết trên sắc ký bản mỏng, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định.
b. Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)
Nguyên tắc: Nhờ có khí mang có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký đƣợc diễn ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả.
Cấu tạo thiết bị:
Thiết bị đƣợc cấu tạo bởi 2 phần: phần sắc kí khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần phổ khối (MS), mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối.
Hình 1.10. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ
Sắc kí ghép khối phổ (GC-MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp nhƣ không khí, nƣớc... Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống nhƣ việc lấy dấu vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó đƣợc so sánh với một thƣ viện cấu trúc các chất đã biết. Nếu không tìm ra đƣợc chất tƣơng ứng trong thƣ viện thì nhà nghiên cứu có thể dựa trên cấu trúc mới tìm ra đƣợc để phát triển các ý tƣởng về cấu trúc hóa học [18].
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU