6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu: Các bộ phận của Đại tƣớng quân hoa trắng đƣợc thu hái trên cùng cây tại Hòa Vang - Đà Nẵng vào tháng 8/2017.
Hình 2.1. Náng hoa trắng dùng trong nghiên cứu (tháng 8/2017)
Các bộ phân của cây Đại tƣớng quân hoa trắng sau thu hái đƣợc tách riêng, rửa sạch, để khô trong không khí, nghiền mịn, bảo quản trong bao polyetylene và đựng trong hộp có nắp, để nơi râm mát theo quy định bảo quản bột dƣợc liệu.
2.1.2. Hóa chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (P), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu của luận văn này đƣợc đƣa ra trên Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong luận văn
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc
1 Hexane Tinh khiết TCCS Trung Quốc
2 Ethyl acetate Tinh khiết TCCS Trung Quốc 3 Ethanol 96% Tinh khiết TCCS Trung Quốc
4 Diclometan Tinh khiết TCCS Trung Quốc 5 H2SO4 (98%) Tinh khiết TCCS Trung Quốc 6 (Bi(NO3)3.H2O 98% TCCS Trung Quốc
7 KI Tinh khiết TCCS Trung Quốc
8 HCl đặc Tinh khiết TCCS Trung Quốc
9 HgCl2 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
10 NaOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
11 AgNO3 99,8% TCCS Trung Quốc
12 NH4OH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
13 Vanillin Tinh khiết TCCS Trung Quốc
14 Methanol Tinh khiết TCCS Trung Quốc
15 Fe2(SO4)3 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
16 CH3COOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
17 KOH Tinh khiết TCCS Trung Quốc
18 Formol 36% Tinh khiết TCCS Trung Quốc
19 Na2SO4 Tinh khiết TCCS Trung Quốc
Sắc ký bản mỏng dùng loại đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2mm (Art. 5554).
Sắc ký cột sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,063 - 0,200mm).
Các sắc ký bản mỏng sau khi đã chấm mẫu đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại ở 254 và 365nm hoặc phun thuốc thử vanilin-H2SO4 5% và sấy ở trên 1000C, để phát hiện chất.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh, phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Đèn UV bƣớc sóng 254 và 365nm. - Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC-MS.
2.2. PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THU NHẬN CÁC MẪU CAO CHIẾT 2.2.1. Phƣơng pháp ngâm dầm (chiết rắn - lỏng) điều chế tổng cao 2.2.1. Phƣơng pháp ngâm dầm (chiết rắn - lỏng) điều chế tổng cao ethanol
a. Mục đích: Ngâm chất rắn (đã đƣợc nghiền nhỏ) vào dung môi thích hợp ở nhiệt độ và thời gian xác định. Sau đó lọc lấy phần dung dịch rồi cô đuổi dung môi ở áp suất thấp nhằm mục đích lấy lƣợng chất có khả năng hòa tan trong dung môi đó. Có thể lặp lại vài lần để lấy hết lƣợng chất.
b. Cách tiến hành: Lấy một lƣợng xác định bột mẫu nghiên cứu ngâm chiết bằng ethanol 960 ở nhiệt độ phòng, thời gian ngâm chiết 24 giờ, sử dụng máy khuấy (hoặc lắc đều sau mỗi 15 phút) để đảm bảo cho sự khuyếch tán tốt. Lọc gạn lấy phần dịch chiết rồi tiếp tục lọc qua giấy lọc trên phễu Buchle. Lặp lại 4 lần, lần đầu dùng 10 lít ethanol, những lần sau mỗi lần dùng 5 lít ethanol. Gộp các dịch chiết và cất loại ethanol dƣới áp suất giảm ta đƣợc tổng cao ethanol. Cân xác định khối lƣợng cao thu đƣợc và tính % khối lƣợng cao chiết so với khối lƣợng mẫu ban đầu.
c. Tính toán kết quả: Hàm lƣợng các cao phân đoạn tách từ tổng cao ethanol đƣợc tính theo công thức:
2.2.2. Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng tách các phân đoạn cao từ tổng cao ethanol
a. Mục đích: Dùng các dung môi có tính phân cực khác nhau để phân tách và thu nhận các loại cao chứa các nhóm hợp chất có độ phân cực khác nhau từ tổng cao ethanol (chứa hầu nhƣ tất cả các hợp chất hữu cơ của trong cây Náng hoa trắng).
b. Cách tiến hành: Lấy cao ethanol (khoảng 100g) thu đƣợc đem phân tán vào 200ml nƣớc cất (vì cao ethanol khó tan ngay trong nƣớc nên ban đầu ta hòa nhuyễn bằng 20ml ethanol 960, sau đó thêm dần nƣớc, dùng đũa thủy tinh hay thìa
% mcao ethanol = x 100 mcao ethanol mmẫu dƣợc liệu khảo sát
inox loại nhỏ khuấy đều để cao phân tán đều trong nƣớc) rồi cho vào bình thủy tinh có nút kín loại 1 lít. Sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lƣợt với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần là hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 500ml dung môi, thời gian lắc chiết mỗi lần là 3 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi chuyển vào phễu chiết, khi thấy tách lớp hoàn toàn (chừng 1 – 2 giờ), chiết riêng phần dung môi và phần dịch nƣớc, xác định thể tích phần dung môi (bằng ống đong), cho vào chai chứa loại 500ml, làm khan bằng cách thêm vào 1 thìa Na2SO4 khan, lắc nhẹ, để lắng rồi trích mẫu thử. Gộp dịch chiết của cả 3 lần (với từng dung môi), cô đuổi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc phân đoạn cao hexane, cao dichloromethane, cao ethyl acetate và cao nƣớc từ cao tổng ethanol.
c. Tính toán kết quả: Hàm lƣợng các cao phân đoạn tách từ tổng cao ethanol đƣợc tính theo công thức:
2.3. ĐỊNH TÍNH NHÓM CHẤT BẰNG CÁC THUỐC THỬ ĐẶC TRƢNG
Các nhóm chất trong các phân đoạn cao tách từ tổng cao ethanol đƣợc định tính bằng các thuốc thử hóa học nhƣ sau:
2.3.1. Định tính alkaloid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml.
Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính
Ống 2: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính.
Ống 3: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Wagner, nếu xuất hiện kết tủa màu cam nâu là phản ứng dƣơng tính.
2.3.2. Định tính flavonoid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml dịch lọc.
% mcao phân đoạn = x 100 mcao phân đoạn mcao ethanol
Ống 1: Thêm vào 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là phản ứng dƣơng tính.
Ống 2: Thêm vào 1-2 giọt NaOH 1%/etanol, nếu xuất hiện màu đỏ đậm hoặc đỏ tím thì phản ứng dƣơng tính.
Ống 3: thêm vào 1-2 giọt AlCl3/etanol 1%, nếu xuất hiện màu xanh lục là phản ứng dƣơng tính.
2.3.3. Định tính sesquiterpen-lacton
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml chloroform, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào ống nghiệm 5ml dịch lọc, thử bằng thuốc thử Tollen, nếu có lớp gƣơng bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc có kết tủa Ag màu đen dƣới đáy ống nghiệm thì phản ứng dƣơng tính.
2.3.4. Định tính steroid
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml clorofom, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 5ml dịch lọc.
Ống 1: Thêm vào 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch đổi sang màu đỏ đậm hoặc xanh tím thì phản ứng dƣơng tính.
Ống 2: Thêm vào 2 giọt dung dịch vanillin 1% trong etanol, 1 giọt HCl đậm đặc. Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh lục hoặc tím thì phản ứng dƣơng tính.
2.3.5. Định tính chất béo
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm vào 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, thêm vào 1-2 giọt H2SO4 50% trong methanol. Nếu xuất hiện màu nâu đen hoặc đỏ tía thì phản ứng dƣơng tính.
2.3.6. Định tính glycoside
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 2ml dd NaOH 10%, đun cách thủy đến khô. Hòa tan cặn trong 5ml chloroform. Lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính.
Phản ứng Keller-Kilian: thuốc thử gồm 100ml axit axetic loãng + 1ml Fe2(SO4)3 5%.
Cách tiến hành: thêm vào mẫu thử 1ml dung dịch thuốc thử, 1-2 giọt H2SO4
2.3.7. Định tính hợp chất phenol
Lấy 0,1 gam cao chiết, thêm 15ml ethanol, khuấy đều, lọc qua giấy lọc. Lấy vào 3 ống nghiệm mỗi ống 5ml dịch lọc.
Ống 1: thêm vào 1-2 giọt thuốc thử Bortrager (KOH 50%/methanol). Nếu xuất hiện màu đỏ, tím hoặc xanh lục thì phản ứng dƣơng tính.
Ống 2: Thêm vào 1ml dung dịch FeCl3 5% trong ethanol. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ thì phản ứng dƣơng tính.
Ống 3: Thêm vào 1ml formol 36%, 1-2 giọt HCl đậm đặc. Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ thì phản ứng dƣơng tính.
2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ 2.4.1. Sắc ký bản mỏng
a. Mục đích: Sắc ký bản mỏng là một kĩ thuật đƣợc dùng để định tính, thử độ tinh khiết, tách chất trong hỗn hợp và đôi khi để bán định lƣợng các hoạt chất.
b. Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng đƣợc mua trên thị trƣờng là loại tráng sẵn silica gel kích thƣớc 20x20cm hoặc 5x10cm.
Với loại kích thƣớc 20x20cm ta cắt bản mỏng ra thành các bản nhỏ có kích thƣớc 1x6,7cm. Dùng bút chì vạch mức xuất phát cách mép dƣới bản mỏng 1cm, vạch kết thúc cách mép trên 0,5cm.
Hình 2.2. Bản mỏng slica gel Kieselgel 60F254 Bước 2: Chuẩn bị bình sắc ký và dung môi giải ly
Bình triển khai dạng hình khối trụ hoặc khối chữ nhật (đƣờng kính lớn hơn bề ngang bản mỏng sử dụng). Cắt các tờ giấy lọc sao cho lọt vừa mặt trong của bình sao
cho vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát thấy bản mỏng bên trong bình và đặt mỗi tờ giấy lọc vào trong mỗi bình.
Cho dung môi triển khai vào bình sao cho lớp dung môi dày khoảng 0,7- 1,0cm, nghiêng bình để dung môi thấm ƣớt tờ giấy lọc. Lƣợng dung môi cho vào mỗi bình sao cho khi nhúng bản mỏng vào bình triển khai thì điểm chấm mẫu vẫn nằm trên cao khỏi mặt thoáng của dung dịch giải ly chứa trong bình). Để yên 5-10 phút làm bão hòa hơi dung môi trong bình (nhờ tờ giấy lọc).
Với mẫu chƣa biết thành phần, chƣa có tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ không phân cực đến phân cực: hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, methanol. Dùng một mặt kính đồng hồ đậy kín bình triển khai để dung môi không bị bay ra trong quá trình sử dụng.
Hình 2.3. Các bình triển khai cho sắc ký lớp mỏng:
(a) dùng cho bản mỏng 1x6,7cm; (b) dùng cho bản mỏng 1x10cm Bước 3: Chấm mẫu lên bản mỏng
Mỗi bản mỏng trƣớc khi chấm mẫu phải hoạt hóa (sấy khô bản bằng máy sấy tóc chừng nửa phút). Dùng vi mao quản nhúng một đầu vào mẫu cao đã đƣợc hòa tan trong dung môi thích hợp, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch vào vi quản. Chấm nhẹ đầu mao quản chứa dung dịch lên trên bản mỏng tại một điểm cách bản 1cm.
Lưu ý: Chạm nhẹ vi quản vào bề mặt bản mỏng để ch tạo thành một điểm tròn nhỏ (vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to và nhìn thấy lỗ trên bề mặt). Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh không lan thành vết chấm to. Có thể chấm thêm vài lần (2 – 5 lần tùy nồng độ mẫu cao trong dung dịch) lên ngay vết chấm cũ để có vết đậm, rõ, nhƣng đƣờng kính không quá 2mm. Nếu cần chấm cùng nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1,0cm, cách đều nhau 1,0cm và cách hai cạnh bên 0,5cm.
Bước 4: Triển khai sắc ký giải ly bản mỏng
Khi cho bản mỏng vào bình triển khai thì phải cầm thẳng đứng bản mỏng rồi mới nhúng vào dung môi trong bình. Khi nhúng vào phải cẩn thận để 2 cạnh bên của bản không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,2 - 0,5cm.
Đậy nắp bình triển khai, dung môi sẽ đƣợc hút lên bản bởi lực hút mao dẫn. Theo dõi khi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung môi đã đƣợc vạch sẵn trƣớc đó (cách đầu bản 0,5cm) thì lập tức lấy bản ra khỏi bình, sấy khô bản bằng máy sấy tóc.
Bước 5: Cách hiện hình vết sắc ký
Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằng các phƣơng pháp hóa học và vật lý phù hợp.
Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thƣờng.
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuric): cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào. Tiếp theo cho 1,2g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay. Dung dịch sau khi pha đƣợc đựng trong bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín.
Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tƣợng phát quang với các tia tử ngoại. Ngoài ra có thể dùng một chất ch thị phát quang tác dụng đƣợc với các cấu tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phƣơng pháp phóng xạ.
Bước 6: Lựa chọn dung môi phù hợp
Với các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất nhƣ nhau và đƣợc giải ly bằng các dung môi đơn hay dung môi hỗn hợp có độ phân cực khác nhau. Dựa trên các vết chất xuất hiện trên các bản mỏng ta xác định đƣợc dung môi không phù hợp để giải ly mẫu:
+ Dung môi là phù hợp khi nó làm cho các chất có mặt trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/4 - 3/4 hoặc 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký.
+ Những dung môi không phù hợp nếu tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát (dung môi đó chƣa đủ phân cực) hoặc tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến (dung môi đó quá phân cực).
Bước 7: Xác định hệ số di chuyển (Rf)
Sử dụng bản giải ly với dung môi phù hợp nhất, nhận xét về màu sắc và xác định hệ số di chuyển từ giá trị Rf của các vết thu đƣợc. Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = a/b (Rf: ch có giá trị từ 0 đến 1).
Trong đó: a: là khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu. b: là khoảng cách (cm) từ điểm xuất phát đến mức dung môi
đo trên cùng đƣờng đi của vết.
2.4.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
a. Mục đích: Sắc ký cột dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất.
b. Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cột sắc ký, bình hứng, chất hấp thu và mẫu cao
Chuẩn bị cột sắc ký: Tùy theo lƣợng cao mà sử dụng cột sắc ký thích hợp tƣơng ứng.
Hình 2.5. Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột
(a): d=5cm và h=50cm; (b): d = 1.5cm và h = 45cm; (c): d = 1.0cm và h = 45cm
Với lƣợng cao ban đầu chừng 10gam thì dùng côt sắc ký có đƣờng kính ngoài 3,5cm và chiều cao làm việc cột là 50cm, lƣợng silica gel cho vào cột là 135gam, dung môi ổn định là hexane. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn silicagel không bị chảy xuống khi giải ly.
Chuẩn bị bình hứng:
Hình 2.6. Các bình hứng dung dịch giải ly
Chuẩn bị chất hấp thu silica gel: chất hấp thu dạng sệt đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cho chất hấp thu vào Trong một becher đã có sẵn dung môi, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lƣu ý không đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không đƣợc quá loãng.
Chuẩn bị mẫu: nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp nhƣ methanol/ethanol rồi trộn với một lƣợng silica