6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN
2.4.2. Phƣơng pháp sắc ký cột
a. Mục đích: Sắc ký cột dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào tính phân cực của từng chất.
b. Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cột sắc ký, bình hứng, chất hấp thu và mẫu cao
Chuẩn bị cột sắc ký: Tùy theo lƣợng cao mà sử dụng cột sắc ký thích hợp tƣơng ứng.
Hình 2.5. Các cột sắc ký dùng cho sắc ký cột
(a): d=5cm và h=50cm; (b): d = 1.5cm và h = 45cm; (c): d = 1.0cm và h = 45cm
Với lƣợng cao ban đầu chừng 10gam thì dùng côt sắc ký có đƣờng kính ngoài 3,5cm và chiều cao làm việc cột là 50cm, lƣợng silica gel cho vào cột là 135gam, dung môi ổn định là hexane. Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn silicagel không bị chảy xuống khi giải ly.
Chuẩn bị bình hứng:
Hình 2.6. Các bình hứng dung dịch giải ly
Chuẩn bị chất hấp thu silica gel: chất hấp thu dạng sệt đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cho chất hấp thu vào Trong một becher đã có sẵn dung môi, mỗi lần một lƣợng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng. Lƣu ý không đƣợc thực hiện ngƣợc lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất. Lƣợng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không đƣợc quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không đƣợc quá loãng.
Chuẩn bị mẫu: nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lƣợng nhỏ dung môi thích hợp nhƣ methanol/ethanol rồi trộn với một lƣợng silica gel tƣơng đƣơng. Làm bay hơi dung môi ban đầu bằng để khô tự nhiên (hoặc cô quay chân không) và làm khô trong bình phòng ẩm chừng qua đêm (đƣợc bột silica gel đã tẩm mẫu dạng khô). Lấy ra, nghiền mịn bằng cối chày sứ loại nhỏ, để khô lại trong bình phòng ẩm trƣớc khi dùng. Khi đó mẫu cần sắc ký đã đƣợc trải đều và gắn chặt lên bề mặt các hạt silica gel.
Bước 2: Đưa chất hấp thu lên cột (nhồi cột)
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi hexane (loại kém phân cực nhất) vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Dùng thìa inox cho chất hấp thu vào trong cột, đều đặn các phía, mỗi lần một lƣợng nhỏ, khi lƣợng chất cho vào cột mỗi lần cao thêm khoảng 2cm thì gõ nhẹ đều vào thành cột ở cả 4 phía. Khi lớp dung môi dâng cao cách miệng cột chừng 10cm thì mở nhẹ khoá ở bên dƣới để cột để cho dung môi chảy ra (hứng vào một bình hứng phía dƣới cột và dung môi này sẽ đƣợc rót lại lên đầu cột). Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang.
Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng thìa inox thẳng gạt xoay nhẹ để làm phẳng lớp chất hấp thu phần trên đầu cột. Tiếp tục cho dung môi chảy qua chất hấp thu (hứng lấy và cho lên trở lại) vài lần đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Bước 3: Đưa mẫu lên cột
+ Với mẫu khô, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho lƣợng dung môi đủ để thấm ƣớt hoàn toàn lƣợng mẫu cho vào. Đóng khoá lại, để bắt đầu nạp mẫu vào đầu cột: dùng thìa inox loại nhỏ mức từng thìa cho vào cột qua một phễu hứng thủy tinh cho đến khi hết. Cần canh chừng không cho mẫu và chất hấp thu đầu cột bị khô. Cho thêm một lớp silica gel sạch lên trên mặt thoáng của mẫu, dùng bông thủy tinh, bông gòn hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt trên của cột.
Hình 2.8. Cột sắc ký sau khi đưa mẫu lên cột
+ Nếu mẫu ƣớt, mở khoá cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột. Sử dụng một pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu. Mở khoá bên dƣới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đƣợc thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột (cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô). Dùng pipet cho một luợng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi này để rửa sạch ống mà dung dịch dính trên thành cột. Lặp lại vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu.
Bước 4: Chạy sắc ký cột (giải ly sắc ký cột)
Sử dụng kết quả bản mỏng để lựa chọn dung môi giải ly phù hợp (dung môi làm cho các chất có mặt trong mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau nhất
một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký). Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Khi sử dụng pha tĩnh là silica gel loại thƣờng, hợp chất không phân cực đƣợc giải ly khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực.
Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: ch sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung môi nhƣng trong hỗn hợp tỷ lệ giữa các thành phần không thay đổi, để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn toàn.
Giải ly có nồng độ tăng dần: đôi khi việc sử dụng một dung môi sẽ ch giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn lấy chúng ra khỏi cột phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn. Trong quá trình sắc ký, cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết các cấu tử khác nhau ra khỏi cột. Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm. Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm “gãy’ cột. Cột “gãy” sẽ làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu và vì thế không tách chất tốt đƣợc.
Dung dịch giải ly đƣợc hứng trong các bình thủy tinh nhỏ có đánh số thứ tự trƣớc. Hứng mỗi lọ một thể tích nhƣ nhau, thƣờng là 15ml. Dung dịch trong những lọ hứng đƣợc sẽ đƣợc cho bay hơi bớt dung môi rồi tiến hành kiểm tra vết chất bằng sắc ký bản mỏng. Những lọ nào có vết sắc ký giống nhau sẽ đƣợc gom lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất thấp sẽ thu đƣợc cao của phân đoạn đó.
Bước 5: Chọn phân đoạn để tiếp tục khảo sát
Chọn phân đoạn có lƣợng cao nhiều và có hợp chất cần phân lập để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn có lƣợng cao ít, nhiều tạp chất, bản mỏng có nhiều vết mờ, dính với nhau hoặc kéo đuôi rất khó khảo sát tiếp, vì nếu cô lập đƣợc chất tinh khiết sẽ không đủ lƣợng mẫu để khảo sát cấu trúc hóa học bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại.