6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN
2.1.NGUYÊN LIỆU HA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Diếp c Houttuynia cordata Thun . Saururaceae đƣợc thu mua tƣơi tại Quảng Nam Đà Nẵng vào th ng 10 năm 2017.
Sơ chế:Thu mua mẫu vật tƣơi (cả cây) cắt ỏ rễ ngắt riêng thân l rửa sạch phơi riêng l và thân đến khô xay nhỏ đến độ mịn cần thiết.
Dƣợc liệu l diếp c khô cho ởi hình 2.1
Hình 2.1. Dược liệu lá Diếp cá khô
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
a.Hóa chất
C c dung môi dùng để chiết t ch và tinh chế gồm: methanol n-hexan, ethyl acetate chloroform đã đƣợc cất lại ằng soxhlet ở nhiệt độ sôi của mỗi dung môi để loại ỏ tạp chất chất làm mềm.
Ngoài ra c n sử dụng Na2SO4 khan để làm khan nƣớc và một số hóa chất kh c. Thuốc thử phun lên ản mỏng là vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc.
b. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- M y quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của Ph ng Thí nghiệm phân tích môi trƣờng - Trung tâm khí tƣợng thủy văn Khu vực Trung Trung Bộ số 660 Trƣng Nữ Vƣơng TP. Đà Nẵng.
- Thiết ị đo sắc k khí gh p phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Mỹ phẩm Thực phẩm TP. Huế.
- Bộ chiết soxhlet tủ sấy l nung cân phân tích m y quay cất chân không m y sấy. C c dụng cụ thí nghiệm kh c nhƣ: cốc thủy tinh, bình tam giác ếp c ch thuỷ cốc sứ pipet ình định mức ình hút ẩm nhiệt kế phễu chiết cối chày sứ...
- Sắc kí ản mỏng sử dụng ản mỏng nhôm tr ng sẵn silicagel TLC 60F254 độ dày 0,25 mm, hãng Merck Đức.
- Chất hấp phụ nhồi cột sắc kí là silicagel cỡ hạt 0 04 – 0,06 mm, hãng Merck, Đức.
- C c thiết ị x c định cấu trúc chất của Viện hóa học: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H–NMR, 13C–NMR đƣợc ghi trên máy Bruker Avance–500 MHz, tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 1H–NMR và 13C–NMR.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng ph p x c định các thông số hóa lý
a. Phương pháp trọng lượng
Áp dụng phƣơng ph p trọng lƣợng để x c định c c yếu tố sau: - Độ ẩm của l diếp c tƣơi và l diếp c khô
Dụng cụ, thiết bị: ch n sứ để đựng mẫu tủ sấy ình hút ẩm cân phân tích.
Tiến hành: Ch n sứ có kí hiệu sẵn c c ch n sứ đƣợc rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lƣợng không đổi. Sấy xong để vào ình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ ph ng thì cân khối lƣợng c c ch n sứ.
+ Xác định độ m của lá diếp cá tươi: Lấy vào 3 ch n sứ mỗi ch n khoảng 5 gram l diếp c tƣơi đã đƣợc xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên ch n sứ). Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân cứ tiến hành nhƣ vậy đến khi khối lƣợng của mẫu và ch n sứ giữa 2 lần cân không đổi là đƣợc.
Ghi lại gi trị khối lƣợng đó. Độ ẩm của mỗi ch n là hiệu số khối lƣợng giữa khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi cân. Từ đó suy ra độ ẩm trung ình của 3 mẫu.
+ Xác định độ m tương đối của nguyên liệu bột: cho vào 3 ch n sứ mỗi ch n khoảng 5 gam nguyên liệu ột đã chuẩn ị ở trên. C c ƣớc tiếp theo thực hiện tƣơng tự nhƣ đối với x c định độ ẩm của l tƣơi.
Cách tính độ m: - Độ ẩm mỗi mẫu: 1 2 3 2 (m m ) m % 100% m - Độ ẩm trung ình: 3 1 TB (%) (%) 3
Trong đó m1(gam) : Khối lƣợng ì ch n sứ
m2 (gam) : Khối lƣợng l diếp c an đầu
m3(gam) : Khối lƣợng ch n sứ và mẫu l diếp c sau khi sấy khô (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu
TB (%) : Độ ẩm trung ình - X c định hàm lƣợng tro
Tro toàn phần: Là khối lƣợng cắn c n lại sau khi nung ch y hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dụng cụ: ch n sứ đựng mẫu l nung ình hút ẩm cân phân tích.
Tiến hành: Để x c định hàm lƣợng tro trong l diếp c ta cân khoảng 5 gam l diếp c tƣơi cho vào cốc sứ đã sấy khô và iết chính x c khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa mẫu vào l nung và nung ở 7000C. Sau thời gian tro ho khoảng 12 giờ ta thấy diếp c tƣơi ị tro ho hoàn toàn. Lúc này tro ở dạng ột mịn màu trắng. Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi l nung cho vào ình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi gi trị khối lƣợng. Tiếp tục cho cốc vào l nung nung 30 phút lấy ra thực hiện lại qu trình trên đến khi khối lƣợng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số 0.001 thì dừng lại. Hàm lƣợng tro trong diếp c tƣơi đƣợc tính theo công thức:
1 0 .100% m H m
Trong đó m0 (gam): khối lƣợng mẫu diếp c tƣơi trƣớc khi tro ho m1 (gam): khối lƣợng tro
H (%) : hàm lƣợng tro trong l diếp c
b. Phương pháp vật lý
Sử dụng phƣơng ph p quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để x c định hàm lƣợng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu.
- Giới thiệu phương pháp
Phƣơng ph p AAS đƣợc viết tắt từ phƣơng ph p hấp thụ nguyên tử (Atomic A sorption Spectrophotometric). C c nguyên tử ở trạng th i ình thƣờng thì chúng không hấp thụ hay ức xạ năng lƣợng nhƣng khi chúng ở trạng th i tự do dƣới dạng những đ m hơi nguyên tử thì chúng hấp thụ và ức xạ năng lƣợng. Mỗ i nguyên tử chỉ hấp thụ những ức xạ nhất định tƣơng ứng với những ức xạ mà chúng c ó thể phát ra trong quá trình phát xạ của chúng. Khi nguyên tử nhận năng lƣợng chúng chuyển lên mức năng lƣợng cao hơn gọi là trạng th i kích thích. Qu trình đó gọi là qu trình hấp thụ năng lƣợng của nguyên tử tự do ở trạng th i hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó. Phổ sinh ra trong qu trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử. Phƣơng ph p phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một số nguyên tố nhƣ thế đƣợc gọi là ph p đo phổ hấp thụ nguyên tử .
Ph p đo phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tƣơng đối mới đã và đang ph t triển mạnh m và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kĩ thuật ở c c nƣớc ph t triển. Đối tƣợng của phƣơng ph p phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử là lƣợng nhỏ c c kim loại và một số kim trong rất nhiều đối tƣợng mẫu: quặng đất nƣớc kho ng c c mẫu sinh học y học c c sản phẩm nông nghiệp thực phẩm nƣớc uống phân ón vật liệu.
Với trang ị và kỹ thuật hiện nay ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hầu hết c c kim loại và một số kim đến giới hạn nồng độ c ở pp (nanogram) với sai số không lớn hơn 15%.
- Nguyên tắc của phép đo AAS
Trên cơ sở của sự xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử, chúng ta thấy phổ hấp thụ nguyên tử chỉ sinh ra đƣợc khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và trong mức năng lƣợng cơ ản. Do vậy, muốn thực hiện đƣợc ph p đo AAS cần phải thực hiện các công việc sau :
+ Hóa hơi mẫu phân tích đƣa vật mẫu về trạng thái khí.
+ Nguyên tử hóa đ m hơi đó tức là phân ly các phân tử để tạo ra c c đ m hơi các nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích ở trong mẫu có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc. Hai công việc này đƣợc gọi là quá trình nguyên tử hóa mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và ảnh hƣởng đến quyết định kết quả của ph p đo AAS vì nó tạo ra môi trƣờng hấp thụ nguyên tử của ph p đo.
+ Chọn nguồn phát tia sáng có ƣớc sóng phù hợp với nguyên tố phân tích (bức xạ cộng hƣởng) và chiếu vào đ m hơi đó nhƣ vậy phổ hấp thụ s xuất hiện.
+ Thu toàn bộ chùm s ng sau khi đi qua môi trƣờng hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn 1 vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích để hƣớng vào khe đo để đo cƣờng độ của nó.
+ Thu và ghi lại kết quả đo của cƣờng độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị ghi và xử lý thích hợp.
2.2.2. Phƣơng ph p chiết mẫu thực vật
Mẫu thực vật thƣờng đƣợc chiết theo hai cách:
Cách th nh t: Chiết mẫu với dung môi là MeOH ở nhiệt độ thƣờng. Rút
dịch chiết và thêm dung môi mới thực hiện chiết mẫu 4 lần. Dịch chiết thu đƣợc đƣợc cất loại dung môi dƣới p suất giảm ở nhiệt độ 45o
C ằng m y quay cất chân không. Thu đƣợc cao chiết MeOH tổng. Cao chiết tổng này đƣợc chế thêm nƣớc và chiết phân lớp lần lƣợt với n–hexane, EtOAc và MeOH, clorofom ằng phễu chiết. Với mỗi loại dung môi ta c ng thực hiện chiết 3 lần. C c dịch chiết đƣợc cất loại dung môi s thu đƣợc c c cao chiết tƣơng ứng (cao n–hexane, cao clorofom, cao EtOAc, cao MeOH ) để tiếp tục nghiên cứu.
Cách th hai: Mẫu thực vật khô đƣợc chiết lần lƣợt với từng loại dung môi có độ phân cực kh c nhau nhƣ n–hexane, clorofom, EtOAc và MeOH. Với mỗi loại
dung môi đƣợc chiết a lần. Cất loại dung môi dƣới p suất giảm ằng m y quay cất chân không s thu đƣợc c c cao chiết tƣơng ứng để tiếp tục nghiên cứu.
- Đối với kĩ thuật soxhlet
Nguyên tắc:
Chiết soxhlet là một kiểu chiết liên tục đặc iệt thực hiện nhờ một trang thiết ị của nó. Song ở đây pha mẫu là ở trạng th i ột hoặc dạng mảnh hoặc dạng l . C n dung môi chiết (chất hữu cơ) là dạng lỏng.
Ví dụ: chiết lấy tinh dầu melton từ l cây ạc hà ằng dung môi hữu cơ n- hexan hay enzen. Chiết c c thuốc trừ sâu hoặc ảo vệ thực vật trong mẫu rau quả mẫu đất ằng n-hexan. Vì thế đây là kiểu chiết của hệ chiết có thể là cả đồng thể và dị thể mà chất phân tích nằm trong mẫu rắn ột l sợi…
C c trang thiết ị và ví dụ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trang thiết ị của kỹ thuật chiết soxhlet là 2 loại: 1. Hệ soxhlet thƣờng và đơn giản
2. Hệ soxhlet tự động (Auto-soxhlet)
C ch chiết theo hệ (1) là đơn giản vận hành ằng tay. C n c ch (2) là vận hành một c ch tự động. Kĩ thuật này chủ yếu sử dụng để chiết t ch chất hữu cơ nằm trong pha rắn hay ột hay mảnh nhỏ hay c c vật liệu khô (l cây). Vì thế nên nó là hệ chiết dị thể.
Ví dụ:
Chiết soxhlet thƣờng lấy một số hóa chất ảo vệ thực vật từ mẫu rau quả: Lấy 10g mẫu đã đƣợc nghiền nhỏ và trộn đều vào cốc chiết của hệ chiết. Thêm 25-30g Na2SO4 khan 30ml dung môi chiết n-hexan có 20% Cl2H2. Sau đó tiến hành chiết trong 180 phút.
Kĩ thuật này có ƣu điểm là chiết triệt để nhƣng những điều kiện chiết phải nghiêm ngặt thì mới có kết quả tốt. Vì thế hệ thống vận hành chiết tự động cho kết quả tốt hơn nhƣng phải có hệ thống trang ị hoàn chỉnh. Nó thích hợp chiết c c chất hữu cơ từ c c đối tƣợng mẫu kh c nhau. Chất phân tích có trong mẫu rắn ột mẫu xốp khô (l cây)…kĩ thuật này đƣợc ứng dụng chủ yếu để t ch c c hợp chất hữu cơ từ mẫu l cây rau quả hoặc mẫu đất nhƣ ví dụ trên..
Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo c ch thứ nhất. Vì Methanol đƣợc xem là dung môi vạn năng trích li đƣợc hầu hết các hợp chất thiên nhiên trong mẫu nguyên liệu. Nó h a tan đƣợc các chất không phân cực đồng thời c ng có khả năng tạo dây nối hidro với các nhóm phân cực khác. Việc chiết cao tổng trong c c dung môi có độ phân cực từ yếu đến mạnh nhằm tách phân đoạn các hợp chất có độ phân cực tƣơng tự nhau, giúp cho việc phân lập chất bằng sắc kí cột về sau bớt phức tạp. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất, ta có thể dự đo n sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết, từ đó lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí thích hợp.
2.2.3. Phƣơng ph p phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết chiết
Trong luận văn này chúng tôi phân tích và định danh thành phần hóa học c c dịch chiết n-hexan, chloroform, ethyl acetate, metanol của l diếp c ằng phƣơng ph p đo sắc kí khí gh p phổ khối (GC-MS).
Phƣơng ph p GC - MS dựa trên cơ sở nối gh p m y sắc kí khí (GC) với m y khối phổ (MS). C c chất sau khi đi qua cột GC có thể ị ion hóa và có khả năng đầy đủ để phân tích ởi m y khối phổ MS. Kĩ thuật sắc kí cho ph p t ch c c cấu tử của hỗn hợp có đƣợc c c chất nguyên chất để đƣa vào m y khối phổ với khả năng nhận diện rất ƣu việt đặc iệt là những chất có đặc trƣng lƣu giữ giống nhau hoặc tƣơng tự nhau nhƣng có phổ khối kh c nhau nhờ đó có thể nhận diện đƣợc chúng. Phƣơng ph p này chỉ đƣợc giới hạn với chất có thể ốc hơi mà không ị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ x c định dƣới thể hơi.
2.2.4. Phƣơng ph p t ch và tinh chế chất
C c cao chiết trong các dung môi khác nhau đƣợc t ch và tinh chế ằng phƣơng ph p sắc kí cột kết hợp với sắc kí ản mỏng với c c hệ dung môi thích hợp. Sắc kí cột gồm sắc kí cột thƣờng và sắc kí cột nhanh sử dụng silicagel. Trƣờng hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phƣơng ph p kết tinh phân đoạn kết tinh lại để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của c c chất c ng nhƣ theo dõi qu trình t ch chất trên cột ằng sắc kí ản mỏng với hệ dung môi thích hợp.
Trong luận văn này chúng tôi tiến hành tách, tinh chế chất trong cao chiết clorofom của l diếp c sử dụng phƣơng ph p sắc kí cột thƣờng silicagel kết hợp với sắc kí ản mỏng.
2.2.5. Phƣơng ph p x c định cấu trúc hóa học của các chất
Việc x c định cấu trúc hóa học của c c chất sạch đƣợc thực hiện thông qua việc kết hợp c c phƣơng ph p phổ hiện đại nhƣ phổ hồng ngoại (FT–IR) phổ khối (MS) phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) nhƣ 1H–NMR, 13C–NMR. C c loại phổ đƣợc đo tại Viện Ho học – Viện KHCN Việt Nam.
2.2.6. Phƣơng ph p thử hoạt tính sinh học
Dựa theo công dụng của l diếp c trong c c ài thuốc dân gian chúng tôi tiến hành thăm d hoạt tính chống oxi hóa c c dịch chiết từ l diếp c trong đề tài nghiên cứu này.
Phƣơng ph p đ nh gi hoạt tính chống oxi hóa gồm những phƣơng ph p nhƣ phƣơng ph p thông qua ao vây gốc tự do (DPPH), phƣơng ph p dựa vào năng lƣợng khử phƣơng ph p x c định chống oxi hóa trên mô hình dầu- nƣớc.
Hoạt tính chống oxy hóa gần đây đƣợc quan tâm nhiều hơn ởi nó nhƣ một chìa khóa vạn năng cho c c nghiên cứu hoạt tính sinh học kh c. C c chất chống oxy hóa đƣợc iết đến nhƣ vitamin E vitamin C lycopen resveratrol và một số chất trao đổi thứ cấp kh c trong cây. C c chất này đƣợc ổ sung vào dƣợc phẩm và thực phẩm chức năng có t c dụng tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể ph ng và điều trị c c ệnh do gốc tự do sinh ra nhƣ tiểu đƣờng tim mạch alzheimer ung thƣ….
C c chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang đƣợc ƣa chuộng do đặc điểm l hóa của chúng nhƣ thân thiện với cơ thể ền nhiệt …. c c chất này thƣờng có ản chất là c c polyphenon. Theo nhƣ tài liệu đã công ố chi Houttuynia rất giàu polyphenon và c ng có hoạt tính chống oxy hóa tƣơng đối cao. Do vậy chúng tôi