6. Cấu trúc của luận văn
2.1. THIẾT BỊ DỤNG CỤ HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị - dụng cụ
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS
- Máy sắc ký lỏng cao áp (Công ty cổ phần dược DANAPHA, Đà Nẵng) - Tủ sấy, lị nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, phễu chiết, nồi áp suất, bình hút ẩm, buret, phễu lọc chân khơng, bếp điện,…
2.1.2. Hóa chất - Vỏ bứa - Vỏ bứa - Etanol - KOH rắn, NaOH rắn - Cồn 90oC - Cồn tuyệt đối - Than hoạt tính - Nước cất - Dung dịch chuẩn HCl 0,1N
2.2. SƠ ĐƠ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Khảo sát các yếu tố
Cô lọc Dịch cô đặc
Đo phổ HPLC Đo phổ IR, phổ cộng
hưởng hạt nhân
Xác định hàm lượng
axit Xác định cấu trúc muối HCK
Chứng ninh bằng dung môi KOH,NaOH -Nồng độ -Khối lượng -Nhiệt độ -Thời gian Dịch chiết Dịch lọc Xác định độ ẩm Lá, vỏ quả Bứa Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu sau khi xử lý Đo hàm lượng tro Đo thành phần kim loại nặng -Làm sạch -Hong khô -Xay nhỏ Tẩy màu, dùng cồn tẩy màu pectin
2.3. NGUYÊN LIỆU
2.3.1. Điều tra sơ bộ cây bứa
Mô tả cây và lá bứa: Cây cao 6-7m. Cành và nhánh dài, mảnh, mọc xòe ngang. Vỏ cây màu xám tro. Lá mọc đối, mép nguyên, nhẵn bóng, có nhiều điểm nở. Vỏ quả màu vàng ở ngồi, phía trong hơi đỏ, vị chua, có nhiều múi mọng nước, ăn được. Hoa có màu vàng nhạt, mọc thành chùm. Quả chín thường được hái về ăn, vỏ quả phơi khô dùng làm thuốc chữa một số bệnh.
2.3.2. Thu nguyên liệu
Quả bứa được hái từ xã Bình Hải và xã Bình Hồ, huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi.
Tên khoa học: Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth., thuộc họ Măng
cụt - Clusiaceae.
Chọn quả có màu vàng quả mọng mang đài tồn tại, vỏ quả dày, có khía múi, phía trong hơi đỏ chứa 6-10 hạt. Bảo quản trong thùng giấy, không ẩm ướt.
Hình 2.2. Quả bứa và lá bứa tươi
2.3.3. Xử lý nguyên liệu
Sau khi thu hoạch, rửa sạch lá, quả bứa để loại bỏ tạp chất và bụi bẩn bám trên bề mặt quả bứa. Hong khô cho đến khi bề mặt lá, quả khơ hồn tồn,
tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ rồi tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 80oC trong vòng 36 giờ. Xay nhỏ nguyên liệu để chiết tách, thu nhận và chuyển hóa axit HCA.
Hình 2.3. Vỏ quả bứa cắt nhỏ và vỏ bứa xay mịn
2.4. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VẬT LÝ 2.4.1. Độ ẩm
Cân khoảng 10g lá, vỏ quả bứa khô cho vào cốc thủy tinh đã được sấy khô và biết khối lượng chính xác (lá riêng, vỏ riêng). Cho cốc thủy tinh có chứa vỏ quả bứa vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 80oC. Sau khi sấy 3 giờ, ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân khối lượng trên cân phân tích. Cứ làm vậy cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là khơng đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Dựa vào các kết quả thu được, ta tính được khối lượng vỏ bứa trước và sau khi sấy. Từ đó tính được độ ẩm vỏ quả bứa.
2.4.2. Hàm lượng tro
Để xác định hàm lượng tro trong vỏ quả bứa, ta cân khoảng 4g vỏ quả đã được sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khơ và biết chính xác khối lượng. Cho
cốc sứ có chứa vỏ vào lị nung và nung ở 800oC. Sau một thời gian tro hóa khoảng 6 giờ, ta thấy vỏ được tro hóa gần như hồn tồn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. Dùng kẹp dài lấy cốc sứ ra khỏi lị nung rồi cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân khối lượng trên cân phân tích.
Sau 30 phút tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là khơng đổi hoặc sai số 0,001g thì dừng q trình tro hóa.
- Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
Dùng cân phân tích cân chính xác từ 1-1,5g mẫu, cho vào chén sứ nung ở 700oC trong 6 giờ cho đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng. Để nguội chén sứ, đem định mức thành 50ml bằng nước cất, tiến hành đo quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS để xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ quả bứa khô.
2.4.3. Chiết tách axit HCA bằng phương pháp chưng ninh
Cân mẫu vỏ quả bứa khơ dạng bột mịn cho vào bình cầu 1000ml có gắn ống sinh hàn chiết chưng ninh (cách thủy) với 200ml dung môi kiềm, trong thời gian 3 giờ. Lọc dịch chiết bằng giấy lọc, phần dịch lọc bỏ etanol tủa pectin theo tỉ lệ thể tích là 4:6. Để khoảng 2 tiếng đồng hồ cho tủa hết, dùng giấy lọc để lọc phần tủa pectin và dịch lọc. Phần tủa pectin tiếp tục rửa bằng nước, thu lấy nước lọc trộn với phần dịch chiết ở trên đem tẩy màu bằng than hoạt tính, ngâm trong nước ấm khoảng 30 phút, lọc bằng giấy, rửa giấy lọc 2 lần bằng 20ml nước cất. Cô dịch lọc về 50ml rồi bảo quản ở 40C, kiểm tra sản phẩm bằng phương pháp HPLC.
Hình 2.4. Dịch chiết trước khi tẩy Hình 2.5. Dịch chiết sau khi tẩy màu
2.4.5. Khảo sát tổng lượng axit thu được trong quả bứa bằng phương pháp chuẩn độ axit – bazơ
Mỗi mẫu dịch sau khi xử lí và cơ đặc, lấy 5ml và thêm vài giọt phenolphtalein để chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Nhỏ dung dịch NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây. Ghi lại kết quả. Mỗi mẫu chuẩn độ 3 lần.
2.4.6. Xác định sản phẩm HCK tạo thành bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Sản phẩm được gửi đến trung tâm Kĩ thuật để kiểm tra bằng HPLC, so sánh với phổ chuẩn của axit HCA, dựa vào thời gian lưu xác định được thành phần HCK và dựa vào diện tích peak xác định được hàm lượng HCK trong sản phẩm muối.
Xác định hàm lượng HCA trong các mẫu theo dung môi bằng phương pháp HPLC [14].
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxy citrat tribasic hydrate, cung
cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn như sau:
Tên sản phẩm (Product name): (-)-Calcium threo-hydroxy citrat tribasic
hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% as Ca.
Số sản phẩm (Product number) : 55128
Văn phòng sản xuất (Product brand) : Fluka
Công thức phân tử (Molecular formula) : C12H10Ca3O16.xH2O
Khối lượng phân tử (Molecular Weight) : 530,43 (cơ bản khan)
Diện mạo (màu sắc) : Hơi nâu
Diện mạo (hình thể) : Bột
Chuẩn độ (KT) EDTA 0,1M : 19,4 (CA)%
Hàm lượng cacbon : 24,11%
Hàm lượng hidro : 2,82%
Phổ NMR 1H : Phù hợp
Toàn bộ những thông tin trên được ghi trong Giấy chứng nhận chất lượng ngày: 04 tháng 02 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxy citrat tribasic hydrate
(50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5,0ml nước và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch được trộn lẫn và làm thành 25ml, khuấy trộn và lọc sử dụng giấy lọc. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm [15].
Hình 2.6. Lọ chất chuẩn
Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit citric cho HPLC: Dung dịch chuẩn
axit citric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30ppm sử dụng nước cất 3 lần cất.
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên
cứu gồm máy sắc ký lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại low pressure hãng Knauer và lắp cột sắc ký Knauer C18: 250mm × 4,6 ID × 5m. Bộ tổng hợp dung mơi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Q trình dị được thực hiện bằng detector Knauer UV: khoảng bước sóng 190-740nm. Pha động gồm (A) methanol MeOH vad (B) là axit photphoric 0,01M với tốc độ dịng 1,5ml/m. Q trình tách các peak tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10- 30% trong thời gian 0-25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45
m và tiêm vào HPLC [12].
Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được
thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10-320ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, sau khi rửa giải kết quả thu được các diện tích peak. Đường cong HCA được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện
tích peak (trung bình của 3 lần chạy). Tương tự, đường chuẩn của axit citric được tiêm vào HPLC và thu được các diện tích peak.
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP KĨ THUẬT 2.5.1. Phương pháp trọng lượng [5], [9]. 2.5.1. Phương pháp trọng lượng [5], [9].
a. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lượng không đổi
Cơ sở của phương pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w (1.1) Trong đó: m : khối lượng chung của nguyên liệu (g)
mo : khối lượng của chất khô tuyệt đối (khơng có ẩm) (g) w : khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (g)
Độ ẩm tương đối (ω) của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước
(w) trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm: ω = . 100 = . 100 (1.2)
b. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu
Ngun tắc: Dựa trên ngun tắc tro hóa hồn tồn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 600oC khoảng 6 giờ.
Dùng phương pháp trọng lượng để khảo sát xác định một số đại lượng như: độ ẩm, hàm lượng tro trong vỏ quả bứa.
Hàm lượng tro được xác định bằng công thức: H = . 100% (1.3) Trong đó: mo : khối lượng vỏ quả bứa khơ trước khi tro hóa (g)
m1 : khối lượng tro (g)
H : hàm lượng tro trong vỏ sấy khô (%)
w m w mo + w m1 mo
2.5.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 3,8.
Trong điều kiện bình thường, ngun tử khơng hấp thụ hay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản. Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử. Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi ngun tử đó thì các ngun tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong q trình phát xạ. Lúc đó ngun tử đã nhận năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Q trình đó được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trước hết phải tạo ra được đám hơi nguyên tử tự do và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó, các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lượng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.
Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi. Vì vậy, muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bước sau:
- Hóa hơi mẫu phân tích, đưa về trạng thái khí. Mục đích của q trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích. Có thể ngun tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc bằng kĩ thuật ngun tử hóa khơng ngọn lửa. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS.
- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tử. Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích hướng vào khe đo để đo cường độ của nó.
- Ghi nhận tín hiệu đo và kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp.
Điều kiện tối ưu phép đo AAS với kĩ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa:
- Thành phần của hỗn hợp khí đốt khi khảo sát bằng với thực nghiệm. - Tốc độ dẫn hỗn hợp khí vào mẫu: 5 lít/ phút.
- Chiều cao ngọn lửa được quyết định bởi hỗn hợp khí.
- Bề dày ngọn lửa quyết định độ nhạy của phương pháp, thay đổi bằng cách thay đổi độ nghiêng của burner.
Dùng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng các kim loại trong vỏ quả bứa.
2.5.3. Phương pháp chưng ninh.
Phương pháp chưng ninh là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Đây là một trong những phương pháp chiết tách đơn giản nhất. Có thể chưng ninh từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Có thể dùng bình cầu gắn sinh hàn hồi lưu rồi đun trong bếp cách thủy hay dùng nồi cáp suất để chưng ninh. Đun nóng hợp chất với dung môi trong nồi áp suất hoặc trong bếp cách thủy trong một thời gian nhất định thu được dịch chiết có lẫn bả rắn. Lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi lọc bỏ bã rắn sẽ thu được dịch chiết.
Tuy là phương pháp đơn giản nhưng việc lựa chọn dung môi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung môi sử dụng phải thỏa mãn một số điều kiện sau:
- Hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, khơng hịa tan hay hịa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu, bắt buộc phải có.
- Khơng tương tác hóa học với các cấu tử cần chiết tách. - Thân thiện với môi trường.
- Không gây độc hại cho người sử dụng và môi trường xung quanh. - Dễ kiếm, giá thành rẻ.
- Khơng có tương tác, phá hủy dụng cụ chiết tách…
2.5.4.Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3, 8.
a. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp vật lý và hóa lý dùng để tách và xác định các hợp chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chất phân tích trong pha động (dung mơi) và pha tĩnh (thường là rắn). Phương pháp này được phát minh bởi nhà sinh vật học người Nga - Mikhail Tswest.
Sự phân bố của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh có thể dựa vào một số tính chất: sự hấp phụ, sự trao đổi ion, sự rây phân tử,… Từ đó, người ta phân biệt sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử,5… Cách gọi tên phương pháp sắc ký nó phụ thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động
- Nếu pha động là lỏng thì gọi là sắc ký lỏng. - Nếu pha động là khí thì gọi là sắc ký khí.
Ngồi ra cịn có sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng với pha động là lỏng. Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký kết hợp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, giải hấp. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ