6. Cấu trúc của luận văn
2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP KĨ THUẬT
2.5.3. Phương pháp chưng ninh
Phương pháp chưng ninh là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Đây là một trong những phương pháp chiết tách đơn giản nhất. Có thể chưng ninh từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Có thể dùng bình cầu gắn sinh hàn hồi lưu rồi đun trong bếp cách thủy hay dùng nồi cáp suất để chưng ninh. Đun nóng hợp chất với dung môi trong nồi áp suất hoặc trong bếp cách thủy trong một thời gian nhất định thu được dịch chiết có lẫn bả rắn. Lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi lọc bỏ bã rắn sẽ thu được dịch chiết.
Tuy là phương pháp đơn giản nhưng việc lựa chọn dung môi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung môi sử dụng phải thỏa mãn một số điều kiện sau:
- Hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, khơng hịa tan hay hịa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu, bắt buộc phải có.
- Khơng tương tác hóa học với các cấu tử cần chiết tách. - Thân thiện với môi trường.
- Không gây độc hại cho người sử dụng và môi trường xung quanh. - Dễ kiếm, giá thành rẻ.
- Khơng có tương tác, phá hủy dụng cụ chiết tách…
2.5.4.Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3, 8.
a. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp vật lý và hóa lý dùng để tách và xác định các hợp chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chất phân tích trong pha động (dung mơi) và pha tĩnh (thường là rắn). Phương pháp này được phát minh bởi nhà sinh vật học người Nga - Mikhail Tswest.
Sự phân bố của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh có thể dựa vào một số tính chất: sự hấp phụ, sự trao đổi ion, sự rây phân tử,… Từ đó, người ta phân biệt sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử,5… Cách gọi tên phương pháp sắc ký nó phụ thuộc vào trạng thái tập hợp của pha động
- Nếu pha động là lỏng thì gọi là sắc ký lỏng. - Nếu pha động là khí thì gọi là sắc ký khí.
Ngồi ra cịn có sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng với pha động là lỏng. Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký kết hợp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, giải hấp. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
Các ứng dụng của sắc ký: - Phân tích định tính - Phân tích định lượng
- Phân tích dựa vào chiều cao peak - Phân tích dựa vào diện tích peak - Xây dựng đường chuẩn
- Phương pháp chuẩn nội
T=0
T=10’
T=20’
Injector
Injector DetectorDetector
Most
Most Interaction with Stationary Phase Interaction with Stationary Phase LeastLeast Flow of Mobile Phase
Flow of Mobile Phase
T=0
T=10’
T=20’
Injector
Injector DetectorDetector
Most
Most Interaction with Stationary Phase Interaction with Stationary Phase LeastLeast Flow of Mobile Phase
Flow of Mobile Phase
Hình 2.7. Phương pháp sắc ký
b. Cơ sở lý thuyết của sắc ký lỏng cao áp
Sắc ký lỏng là quá trình tách một hợp chất ở trong cột tách ở trạng thái lỏng. Vì thế, mẫu phân tích phải hịa tan trong một chất lỏng nào đó, thường là pha động của q trình sắc ký. Nó thích hợp cho tất cả các chất có nhiệt độ sơi cao cũng như thấp (trừ các chất ở nhiệt độ thường là khí).
Trong những điều kiện sắc ký nhất định thì chất tan ln phân bố trong hai pha theo những cân bằng động từ lúc chất phân tích bắt đầu vào cột cho đến khi nó ra khỏi cột tách, nghĩa là ln ln có sự vận chuyển của chất tan từ pha này sang pha kia và ngược lại. Vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất là khác nhau. Như vậy có một thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột sắc ký và các chất khác nhau sẽ ra khỏi cột tách ở những thời điểm khác nhau. Nếu ghi lại quá trình tách ta được sắc ký đồ gồm nhiều peak. Một quá trình tách tốt nếu các peak không chập nhau, nghĩa là mẫu có bao nhiêu chất thì có bấy
nhiêu peak riêng biệt. Trong quá trình sắc ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ được rửa giải ra khỏi cột sau cùng và chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên.
Sắc ký lỏng có 2 loại:
- Sắc ký lỏng sắc ký thường (cổ điển) - Sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC)
Trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thường, tuy thiết bị rẻ nhưng hiệu suất tách thấp, peak tách khơng hồn tồn, rất tốn dung mơi để rửa giải, tốn nhiều thời gian nên hiện nay người ta dùng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Là kết quả của sự phát triển trong suốt thập kỉ qua về những cải tiến về thiết bị và sự nhồi cột. HPLC nổi lên như một phương pháp được ưa thích cho kĩ thuật tách và phân tích định lượng của một dải rộng các mẫu. Phương pháp HPLC hiện đại, nhanh, hiệu quả. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như khơng có giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghệ.
Pha tĩnh (nghĩa là đứng yên) trong sắc ký lỏng có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành cột sắc ký nhồi. Pha tĩnh lỏng được giữ lại trong cột nhờ chất mang trơ, nó là một màng mỏng (1-3mm) bám xung quanh hạt chất mang. Loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn. Điều kiện của pha tĩnh:
- Trơ với pha động và bền vững với các điều kiện của mơi trường sắc ký. - Khơng có phản ứng phụ với dung mơi rửa giải hay chất phân tích. - Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện ắc ký nhất định.
- Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó để các chất phân tích hấp phụ trên bề mặt, khơng bị thay đổi, biến dạng, không bị phân rã dưới ánh sáng cao (Al2O3, SiO2).
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Bề mặt hạt tương đối đồng đều, thường dùng dạng hình cầu (thể tích giữa các hạt rất nhỏ, đặc khít), đường kính hạt lớn nhất so với hạt nhỏ nhất không hơn kém nhau quá 15%.
Pha động trong sắc ký lỏng cao áp tùy thuộc vào mỗi loại chất nhồi cột khác nhau. Nó có thể là một dung môi đơn, hỗn hợp của hai hay ba dung môi trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ phù hợp, song với bất kỳ loại sắc ký nào thì yêu cầu của dung môi làm pha động cũng phải thỏa mãn những yêu cầu nhất định sau:
- Trơ và khơng có tác dụng hóa học với pha tĩnh, khơng làm hỏng pha tĩnh.
- Bền, ổn định và không bị phân hủy trong q trình chạy sắc ký.
- Hịa tan tốt hỗn hợp chất mẫu, có như thế mẫu mới có thể vận chuyển từ đầu cột tách đến cuối cột tách.
- Phù hợp với loại detector đã chọn để phát hiện chất phân tích. - Có độ tinh khiết cao để tránh nhiễm bẩn mẫu.
Thực tế, người ta thường dùng hỗn hợp dung môi như methanol + nước, axetonitril + nước, n-hexan + axeton…)
Trong HPLC, hỗn hợp cần phân tích được hịa tan trong một dung mơi thích hợp, tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung mơi (pha động) trong đó mẫu được hịa tan. Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh. Pha động (chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc ký. Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lượt thốt ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu được ghi
lại và chuyển ra ngoài một sắc ký đồ, cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dưới dạng một peak. Khi đó, lượng cấu tử có trong mẫu được tính tốn dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp để xác định định lượng riêng biệt các axit hữu cơ có trong mẫu chiết: axit hydroxy citric và axit citric có trong vỏ quả bứa; xác định thành phần HCK trong sản phẩm muối chuyển hóa dựa vào diện tích peak và thời gian lưu so với phổ chuẩn.