5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu
a. Thu gom nguyên liệu
Các bộ phận của cây ruốc cá đƣợc thu hái từ huyện Nông Sơn, tỉnh Quảng Nam.
b. Xử lí nguyên liệu
Rễ, lá, hạt của cây ruốc cá sau khi hái, đƣợc rửa sạch bằng nƣớc, để khô. - Đối với rễ cây: Cắt nhỏ, sấy ở 40oC trong 2 ngày rồi đem nghiền thành bột mịn.
- Đối với lá cây: Sấy ở 40oC trong 4 giờ rồi đem nghiền thành bột mịn.
- Đối với hạt cây: Tách lớp vỏ, lấy hạt bên trong, sấy ở 40oC trong 8 giờ rồi đem nghiền thành bột.
Lưu ý: Nguyên liệu không đƣợc đem đi phơi khô bằng ánh nắng mặt trời mà phải đƣợc giữ trong bóng râm; nhằm tránh các hoạt chất bị phân hủy bởi ánh sáng mặt trời.
2.1.2. Hóa chất
- Sử dụng trong thực nghiệm hóa học:
+ Methanol (Trung Quốc), Chloroform (Trung Quốc), Ethyl acetate (Trung Quốc), Methanol (Trung Quốc), Hexane (Trung Quốc), Aceton (Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc).
+ Silicagel bản mỏng (Merck), Silicagel chạy cột (Merck). + Nƣớc cất.
- Sử dụng trong thực nghiệm sinh học: + Peptone
Hình 2.2. Hình ảnh rễ cây ruốc cá được tách vỏ, cắt nhỏ, sấy khô và bột mịn
+ Cao nấm men + Agar + NaCl + Glucozo + Khoai tây + 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride 2.1.3. Thiết bị
- Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GC- MS) của Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm tỉnh Thừa Thiên Huế, 17 Trƣơng Định, Thành phố Huế.
- Thiết bị đo MS và máy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (Viện hóa học Hà Nội).
- Máy lắc, tủ an toàn sinh học, tủ ấm tại khoa Sinh, trƣờng Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng.
- Bộ chiết soxhlet, bộ dụng cụ chiết, thiết bị cô quay chân không của khoa Hóa, Đại học Sƣ phạm Đà Nẵng.
- Tủ sấy, lò nung, cân phân tích, máy đo pH. Các dụng cụ thí nghiệm khác nhƣ: cốc thủy tinh, bình tam giác, chén sứ, ống nghiệm, bếp cách thủy, pipet, bình định mức, nhiệt kế, bình hút ẩm, giấy lọc…
- Cột sắc ký (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2. THỰC NGHIỆM
2.2.1. Khảo sát hoạt tính sinh hoạt các bộ phận của cây ruốc cá
Khảo sát hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch tiêu chuẩn tại phòng thử hoạt tính sinh học – Khoa Sinh, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đà Nẵng.
Các chủng vi sinh vật thử gồm: - Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus.
- Vi khuẩn Gram (-):Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia Coli.
- Nấm: Fusarium
Với lần lƣợt các dịch chiết đƣợc kí hiệu nhƣ sau:
Hình 2.4. Bộ dụng cụ chiết soxhlet Hình 2.5. Bộ cất quay chân không
Dịch 1: 5g bột rễ cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 2: 5g bột lá cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 3: 5g bột hạt cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 4: 5g tươi xay nhuyễn (2g ớt + 2g gừng +1g tỏi) trong 10 mL rượu, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 5: 10 mL nước máy thông thường trong phòng thí nghiệm, lấy cùng thời điểm với nước ở trên.
Dịch 6: 10 mL rượu gạo trắng, lấy cùng thời điểm với rượu ở trên.
2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
Lấy 15 gam bột rễ cây ruốc cá, cho vào túi vải lọc trắng. Chiết soxhlet lần lƣợt với các dung môi hexane, ethyl acetat, chloroform, methanol. Mỗi dung môi chiết trong 12 giờ và thu đƣợc dịch chiết. Quá trình chiết soxhlet đƣợc mô tả dƣới Hình 2.11.
Phần dịch chiết đƣợc gửi đi đo GC-MS tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, dƣợc phẩm Thừa Thiên Huế.
Hình 2.9. Sơ đồ chiết bằng dung môi hữu cơ
Thu và xử lý nguyên liệu Bột rễ cây ruốc cá Chiết bằng phƣơng pháp soxhlet Dịch chiết hexane Dịch chiết chloroform Dịch chiết ethyl acetate Dịch chiết methanol Dung môi hexane Dung môi chloroform Dung môi ethyl acetate Dung môi methanol Đo GC-MS
2.2.3. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất
a. Điều chế các cao chiết
Lấy 3 kg bột rễ cây ruốc cá, ngâm với 20 lít dung dịch methanol trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ.
Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, rồi đem cất quay chân không dƣới áp suất thấp để đuổi bớt dung môi. Phần dung môi thu đƣợc sau cô quay tận dụng để chiết tiếp lần sau. Sau đó, đuổi hết dung môi thu đƣợc 100g cao methanol.
Hòa cao methanol với khoảng 50 mL nƣớc cất rồi chiết phân đoạn bằng phễu chiết lần lƣợt với hexane, chloroform và ethyl acetat (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Cặn từ dịch chiết hexane (44g), chloroform (26g), ethyl acetat (18,1g).
Quy trình điều chế các cao chiết đƣợc trình bày ở Hình 2.11.
Cao etyl axetat (18,1g) Cao chloroform (26g) Dịch chiết methanol Cao hexane (44g) Bã còn lại Bã còn lại Bã còn lại Cao methanol (100g)
- Ngâm chiết methanol (3 lần/ 24 giờ) - Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, gộp lại.
-Cất quay chân không thu hồi dung môi.
- Hòa cao methnol với 50 mL nƣớc cất - Chiết phân đoạn với 600 mL hexane, 3 lần.
- Chiết phân đoạn với 600 mL ethyl acetat, 3 lần.
- Chiết phân đoạn với 600 mL chloroform, 3 lần.
Bột rễ cây ruốc cá (3 kg)
b. Chạy cột sắc kí phần cao chloroform
Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho hệ dung môi n–hexane/EtOAc (5:3) vào cốc 500 mL (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lấy 800 gam silicagel (Merck, 0,063 – 0,2 mm) cho vào cốc trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Cho một lƣợng nhỏ bông vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
- Silicagel đƣợc cho vào cột ở dạng sệt nhƣ Hình 2.14.
Phần cao chloroform tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel và pha động là các hệ dung môi n-hexane/EtOAc (5:3), n-hexane/Aceton (5:3), n-hexane/ EtOAc (1:2,5). Quy trình đƣợc trình bày ở hình 2.13.
Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho hệ dung môi n–hexane/EtOAc (5:3) vào cốc 500 mL (lựa chọn hệ dung môi dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lấy 800 gam silicagel (Merck, 0,063 – 0,2 mm) cho vào cốc trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
Cao chloroform 15g
SKC silicagel
n-hexane/EtOAc (5:3) Thu đƣợc 15 phân đoạn
C.9 1,83g
SKC silicagel
n-hexane/Axeton (5:3) Thu đƣợc 6 phân đoạn
C.9.4 0,72g
SKC silicagel
n-hexane/EtOAc (1:2,5) Thu đƣợc 5 phân đoạn
NEW1 0,07g Đo phổ để xác định cấu trúc Thử hoạt tính sinh học
- Cho một lƣợng nhỏ bông vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Nạp mẫu vào cột
- Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp ƣớt.
- Mẫu ƣớt đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu và đũa thủy tinh sau khi đã khoá cột.
Chú ý: Khi cho mẫu vào cột theo phương pháp ướt thì lượng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung môi, không có bọt khí.
- Sau đó cho một lớp silicagel bảo vệ mỏng ở phía trên mẫu.
Chạy cột Silicagel với hệ dung môi n–hexane/EtOAc với hệ dung môi ban đầu n–hexan/EtOAc (5:3), thu đƣợc 15 phân đoạn kí hiệu từ C.1 đến C.15.
Các phân đoạn đƣợc kiểm tra trên sắc kí bản mỏng cho thấy phân đoạn C.9 (1,83 g) cho các vệt rõ ràng. Do vậy, phân đoạn này đƣợc chọn để tiếp tục tách chất.
Hình 2.14. Mẫu được nạp vào cột
Phân đoạn C.9 (1,83 g) sau để cho bay hơi tự nhiên.Kiểm tra lại hệ bằng sắc kí bản mỏng và đƣợc hệ tiếp theo là n-hexan/Axeton (5:3).
Nạp mẫu lên cột silicagel, sau đó xả cột thu đƣợc 6 phân đoạn. Phân đoạn
C.9.4 (0,72g) sau khi đƣợc bay hơi tự nhiên tiếp tục tách chất trên cột silicagel với
dung môi chạy cột là n-hexan/EtOAc (1:2,5), sau đó xả cột thu đƣợc 5 phân đoạn. Ở phân đoạn C.9.4.3 (0,07g), chấm bản mỏng với hệ dung môi n-
hexan/EtOAc(1:2,5) thì thấy chỉ xuất hiện 1 vệt, chiếu đèn UV và hiện thuốc thử H2SO4 10% chỉ cuất hiện một màu vàng nhạt. Chất này đƣợc kí hiệu là NEW 1.
2.2.4. Phƣơng pháp thăm dò hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch tiêu chuẩn tại phòng thử hoạt tính sinh học – Khoa Sinh, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Đà Nẵng.
Các chủng vi sinh vật thử gồm: -Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus.
-Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia Coli.
Với lần lƣợt các dịch chiết đƣợc kí hiệu nhƣ sau:
Dịch 1: 5g bột rễ cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 2: 5g bột lá cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 3: 5g bột hạt cây ruốc cá trong 10 mL nước, ngâm trong 12 giờ.
Hình 2.16. Sắc kí bản mỏng của C.9 dưới đèn UV 254 nm.
Hình 2.17. Sắc kí bản mỏng của C.9 sau khi đã hiện màu bằng
Dịch 4: 5g tươi xay nhuyễn (2g ớt + 2g gừng +1g tỏi) trong 10 mL rượu, ngâm trong 12 giờ.
Dịch 5: 10 mL nước máy thông thường trong phòng thí nghiệm, lấy cùng thời điểm với nước ở trên.
Dịch 6: 10 mL rượu gạo trắng, lấy cùng thời điểm với rượu ở trên.
2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
Sau khi thực hiện xong thí nghiệm, các mẫu sản phẩm đã đƣợc làm sạch, khảo sát các hoạt tính sinh học, xác định cấu trúc hóa học…bằng các phƣơng pháp: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H- NMR; 13C- NMR).
2.3.1. Sắc ký cột
Đây là phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao gồm các loại silicagel (kích thƣớc hạt khác nhau), pha thƣờng cũng nhƣ pha đảo YMC, ODS, dianion,… Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (có thể cột thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhƣng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách các chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại.
Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn thì gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc). Khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.
Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc
vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (từ 1/5-1/10), còn nếu tách tinh thì tỷ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc kí cột, việc đƣa chất lên cột hết sức quan trọng.Tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên cột. Nếu tách tinh, thì đƣa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lƣợng tối thiểu.
Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1 (Nhồi cột khô): Theo cách này, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Tiếp đó, dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2 (Nhồi cột ƣớt): Theo cách này, chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó, đƣa dần vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết.
Lưu ý:
+ Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí sẽ gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột làm giảm hiệu quả tách) và cột không đƣợc nứt, gẫy, dò.
+ Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng đến tiến độ công việc.
Trong khuôn khổ bài luận văn này, tôi tiến hành sắc ký cột với phƣơng pháp nhồi cột ƣớt để đi tách chất.
2.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định hƣớng cho sắc kí cột. SKLM đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn sillicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để tách chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM đƣợc tráng silicagel dày hơn, có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn
lên bản và sau khi chạy sắc ký, ngƣời ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt.
Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại hay bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
Trong khuôn khổ luận văn này, tôi sử dụng SKLM để định hƣớng cho sắc kí cột.
2.3.3. Phổ khối lƣợng (MS)
Phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân chia mảnh ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các peak ion mảnh khác nhau mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiêu loại phổ khối lƣợng, những phƣơng pháp chủ yếu đƣợc nêu ra dƣới đây:
+ Phổ EI-MS: Dựa vào sự phân mảnh ion dƣới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lƣợng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
+ Phổ ESI-MS: Gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là peak ion phân tử và các peak đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ bị phá vỡ.
+ Phổ FAB: Là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử ở năng lƣợng thấp, do đó phổ cũng dễ thu đƣợc peak ion phân tử.
+ Phổ khối lƣợng phân giải cao: Cho phép xác định peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay ngƣời ta còn sử dụng kết hợp các phƣơng pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác nhƣ: GC - MS (sắc ký khí - khối phổ), LC - MS (sắc kí lỏng - khối phổ). Các phƣơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dƣợc).
Trong bài luận văn này, tôi sử dụng phƣơng pháp GC - MS (sắc ký khí - khối phổ) để xác định thành phần hóa học trong dịch chiết rễ cây ruốc cá bằng các dung môi hữu cơ n-hexane, chloroform, methanol, ethyl acetat.