5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.2.2. Kết quả xác định thành phần hóa học của các chất trong dịch chiết
bằng phƣơng pháp GC-MS
a. Thành phần hóa học của các chất trong dịch chiết hexane
Sắc ký đồ GC của dịch chiết hexane đƣợc thể hiện trên Hình 3.16. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết hexane đƣợc trình bày ở Bảng 1
Bảng 3.2. Thành phần hóa học trong dịch chiết hexane
TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo
1 8.0 7.1 Cyclopentene-3-heptyl C12H22 2 8.3 2.8 Dodecane C12H26 3 8.9 0.5 Cyclopropane C3H6 Hình 3.16. Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết hexane
TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo 4 11.1 6.3 Tetradecane C14H30 5 11.2 0.7 2-Nonen-1-ol C9H18O 6 11.5 0.8 2-Nonenal,2-pentyl C14H26 7 11.9 1.6 Pyrimidinetetramine C4H8N6 8 12.1 1.4 Endo-Isofenchol C10H18O 9 12.3 2.4 6,11-Hexadecadien-1ol C16H30O 10 13.5 7.2 Hexadecane C16H34 11 14.7 1 9.4 Germacrane-A C15H30
TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo 12 15.8 6.6 Octadecane C18H38 13 17.8 5.8 Eicosane C20H42 14 17.9 3.3 Hahnfett 15 19.6 5.5 Pentacosane C25H52 16 21.2 18 Di(2- ethylhexyl)adipate C22H42O4 17 21.3 5.4 Tetracontane 18 22.6 3.0 Vindolinine C21H24N2O2 19 22.8 2.1 Tabersonin C21H24N2O2
Kết quả thu đƣợc ở Bảng 1 cho thấy trong dịch chiết hexane có 19 cấu tử đã đƣợc định danh. Các cấu tử có hàm lƣợng tƣơng đối lớn bao gồm: Germacrane-A
(19.43%), Cyclopentene-3-heptyl (7.18 %), Tetradecane (6.30%), Di(2-ethylhexyl) adipate (17.75 %), Octadecane (6.26 %), Hexadecane (7.29 %), Eicosane (5.83%).
b. Thành phần hóa học của các chất trong dịch chiết chloroform
Sắc ký đồ GC của dịch chiết hexane đƣợc thể hiện trên Hình 3.17. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform đƣợc trình bày ở Bảng 2.
Bảng 3.3. Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform
TT TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo
1 29.4 0.30 2- Benzylbenzimidazole C12H9N3 2 29.6 0.38 Stigmasterol C29H48O Hình 3.17. Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết chloroform
TT TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo 3 30.9 1.16 Clionasterol C29H50O 4 31.8 43.46 Metyl commate A C31H50O3 5 32.0 3.70 Lupeyl acetate C32H52O2 6 33.5 47.2 Tri-O- methylparvisoflavone- A C23H22O6 7 34.0 0.33 Brucine C23H26N2O4
TT TR % Tên cấu tử CTPT Công thức cấu tạo 8 34.6 0.92 Lupeyl acetate C32H52O2 9 36.2 0.23 Rotenone C23H22O6 10 37.5 0.69 Scandinone C26H26O5
Kết quả thu đƣợc ở Bảng 2 cho thấy dịch chiết chloroform có 10 cấu tử đã đƣợc định danh. Các cấu tử có hàm lƣợng tƣơng đối lớn chủ yếu là các hợp chất: Metyl commate A (43.46 %), Tri-O-methylparvisoflavone-A (47.2 %), Lupeyl acetate (3.70 %).
c. Thành phần hóa học của các chất trong dịch chiết ethyl acetate
Sắc ký đồ GC của dịch chiết hexane đƣợc thể hiện trên Hình 3.18. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform đƣợc trình bày ở Bảng 3.
Bảng 3.4. Thành phần hóa học trong dịch chiết Ethyl Acetate
TT TR % Tên cấu tử -CTPT Công thức cấu tạo
1 9.5 0.64 Anethole C10H12O 2 31.4 48.64 Methyl commate A C31H50O3 3 31.9 45.7 Tri-O- methylparvisoflavone-A C23H22O6
TT TR % Tên cấu tử -CTPT Công thức cấu tạo
4 32.1 3.83 Dihydrosanguilutine C23H25NO6
5 33.3 1.19 Norolean-12-ene C29H46O
Kết quả thu đƣợc ở Bảng 3 cho thấy trong dịch chiết ethyl acetat có 5 cấu tử đƣợc định danh, trong đó Tri-O-methylparvisoflavone-A (45.7 %), Methyl commate A (48.64 %), Dihydrosanguilutine (3.83 %).
d. Thành phần hóa học của các chất trong dịch chiết Methanol
Sắc ký đồ GC của dịch chiết methanol đƣợc thể hiện trên Hình 3.19. Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết Methanol đƣợc trình bày ở Bảng 4
Hình 3.19. Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết Methanol
Bảng 3.5. Thành phần hóa học trong dịch chiết methanol
TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo
1 8.6 0.12 2,3-Dihydro-Benzofuran C8H8O 2 9.5 0.10 Anethole C10H12O 3 9.9 0.10 Phenol,4-ethenyl- 2methoxy C9H12O2 4 10.3 0.03 2,6-Dimethoxylphenol C8H10O3 5 15.1 0.19 Coniferyl alcohol C10H12O3 6 29.6 3.50 Trans-Asarone 7 31.9 48.3 Methyl commate A C31H50O3 8 32.1 5.92 Lupeyl acetate C32H52O2
TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo 9 32.7 38.54 Tri-O- methylparvisoflavone-A C23H22O6 10 34.6 0.99 Lupeyl acetate C32H52O2 11 35.1 0.28 Cycloartenol C30H50O 12 36.3 0.25 Rotenone C23H22O6 13 37.6 1.46 Scandinone C26H26O5
TR % Tên cấu tử - CTPT Công thức cấu tạo
14 38.4 0.19 Soyasapogenol C30H50O4
Kết quả ở Bảng 4 cho thấy trong dịch chiết Methanol có 14 cấu tử đã đƣợc định danh. Các cấu tử có hàm lƣợng tƣơng đối lớn bao gồm: Methyl commate A (48.34 %), Tri-O-methylparvisoflavone-A (38.54 %), Lupeyl acetate (5.92 %).
Kết quả ở Bảng 4 cho thấy trong dịch chiết Methanol có 14 cấu tử đã đƣợc định danh. Các cấu tử có hàm lƣợng tƣơng đối lớn bao gồm: Methyl commate A (48.34 %), Tri-O-methylparvisoflavone-A (38.54 %), Lupeyl acetate (5.92 %).
Nhận xét chung: Tổng hợp kết quả khảo sát thành phần dịch chiết của 4 phân đoạn dịch chiết Hexane, Chlorofom, Ethyl acetate, Methanol cho thấy: các hợp chất hóa học trong cây ruốc cá chủ yếu là chất có nhóm OH, các hidrocacbon, axit béo, hợp chất có nhiều vòng thơm.
Trong số các hợp chất trên: Chất Metyl commate A là chất hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng (Bacillus subtilis), chống lại bệnh nấm. Bên cạnh đó, Clionasterol cũng là chất kháng khuẩn mạnh và hoạt tính kháng nấm.
Rotenone đã đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc trừ sâu hữu cơ cho các khu vƣờn, không chọn lọc trong hành động, nó giết chết bọ cánh cứng khoai tây, bọ cánh cứng dƣa chuột, bọ cánh cứng bọ chét, sâu bắp cải, bọ mâm xôi và bọ cánh cứng măng tây, cũng nhƣ hầu hết các động vật chân đốt khác. Rotenone nhanh chóng phân hủy sinh học trong điều kiện ấm, vì vậy dƣ lƣợng có hại là tối thiểu.
Stigmasterol là chất chống oxi hóa mạnh, có tác dụng hạ đƣờng huyết, chống viêm khớp, làm giảm cholesterol và đặc biệt là có tác dụng phòng chống ung thƣ ruột kết, ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ vú, ung thƣ buồng trứng.
Lupeyl acetate là một chất ức chế hiệu quả trong các mô hình phòng thí nghiệm ung thƣ tuyến tiền liệt và da. Là một tác nhân chống viêm. Lupeol đã đƣợc tìm thấy có tác dụng tránh thai do tác dụng ức chế của nó trên tinh trùng. Lupeol đã đƣợc chứng minh là có nhiều dƣợc lý khác nhau hoạt động có lợi chống viêm, ung thƣ, viêm khớp, tiểu đƣờng, bệnh tim, nhiễm độc thận và nhiễm độc gan.
Những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu này tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về việc khảo sát các hoạt tính sinh học của cây ruốc cá, phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính tốt từ chúng.
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TÁCH ĐƢỢC 3.3.1. Hình ảnh của chất tách đƣợc
Chất NEW 1 sau khi phân lập xong đƣợc thử lại với sắc kí bản mỏng hệ n- hexane/EtOAc (1:2,5) thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.20.
Sau khi để bay hơi dung môi tự nhiên sau 24 giờ ta thu đƣợc chất rắn mà vàng rất nhạt có khối lƣợng 0,07g. Đƣợc trình bày hình 3.21.
3.3.2. Số liệu phổ của chất tách đƣợc
* Phổ 1H-NMR
Phổ 1H-NMR (hình 3.22) và các phổ 1H-NMR giãn rộng (hình 3.23 và 3.24) cho thấy trong phân tử có mặt nhóm O-CH3 thể hiện qua tín hiệu đặc trƣng ở δH =
3.89 (s, 3H). Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy các tín hiệu của của nhóm –CH(CH3)2 ở δH = 1,48 (s, 7H). Ở tín hiệu ở δH = 5,75 (dd, 1H) cho thấy các tín
hiệu của nhóm OH trong phenol.
Số liệu phổ 1H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Hình 3.21. Chất NEW 1 được phân lập xong.
Hình 3.22. Phổ 1
Hình 3.23. Phổ 1H- NMR giãn rộng của chất NEW 1
Hình 3.24. Phổ 1
Bảng 3.6. Số liệu phổ 1 H-NMR của chất NEW 1 STT Độ chuyển dịch hóa học (δ , ppm) của các mũi cộng hƣởng Vị trí H 1 1.27 d, 4H, J = 8.5Hz CH2 của vòng 3 1.49 s, 7H -C(CH3)2 của C-1 4 2.17s -C=O 6 3.89s, 4H -OCH3 7 4.09 dd, 1H, J = 6Hz và 6Hz -CH của vòng 8 4.29 dd, 1H, J = 2.5Hz - CH của vòng
9 5.76 dd, 1H, J = 10.0Hz - OH của ancol thơm 10 6.46 dd, 1H, J = 10.0Hz -CH của vòng 11 6.78 s, 1H -CH của vòng 12 6.95 d, 1H, J = 8 z -CH của vòng 13 7.02 dd, 1H, J = 2Hz -CH của vòng 14 7.21 d, 1H, J = 2Hz -CH của vòng 16 7.87s, 1H -CH của vòng 17 7.89 s, 1H -CH của vòng
*Phổ 13C-NMR và DEPT của chất NEW 1
Phổ 13C-NMR (hình 3.25) và phổ DEPT từ hình 3.26 của chất NEW 1 cho tín hiệu của 31 nguyên tử C cộng hƣởng từ 20 đến 180 ppm trong đó có 18 nhóm CH, 5 cacbon bậc 4, 7 nhóm CH3 và 1 nhóm CH2.
Hình 3.25. Phổ 13C-NMR của chất NEW 1
* Phổ COSY của chất NEW 1
Hình 3.27. Phổ COSY của chất NEW 1
* Phổ HSQC của chất NEW 1
Trên phổ HSQC của hợp chất NEW 1 xuất hiên tƣơng tác nhƣ sau:
- Giữa proton ở δH 1.27 ppm với carbon ở δC 25.5 ppm và proton ở δH 1.38 ppm với carbon ở δC 26.28 ppm . Vì vậy, peak ở 25.5 ppm và peak ở 26.28 ppm
Hình 3.29. Phổ HSQC của chất NEW 1
trong phổ 13C NMR thuộc nguyên tử carbon vị trí số 28 và 29.
- Giữa proton ở δH ppm với carbon ở δC 131.8 ppm với proton ở δH 5.75 ppm. Vì vậy, peak ở 131.8 ppm trong phổ 13
C NMR thuộc nguyên tử carbon vị trí số 2.
* Phổ HMBC của chất NEW 1
3.3.3. Xác định cấu trúc chất tách đƣợc
Chất đƣợc nhận danh là Methyl commate A C31H50O3 dựa rên kết quả phân tích phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC của NEW
3.4. KẾT QUẢ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Kết quả trên các mẫu thử vi khuẩn
Kết quả thử hoạt tính sinh học đƣợc trình bày ở các hình sau.
Trên mẫu 1 ( Salmonella)
Kết quả thử hoạt tính sinh học trên chủng vi khuẩn Salmonella bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch đƣợc thực hiện ở phòng vi sinh, khoa Sinh học, Đại học Sƣ Phạm Đà Nẵng đƣợc thể hiện ở hình 3.29.
Trên mẫu 2 (E.Coli)
Kết quả thử hoạt tính sinh học trên chủng vi khuẩn E. Coli bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch đƣợc thực hiện ở phòng vi sinh, khoa Sinh học,Đại học Sƣ Phạm Đà Nẵng đƣợc thể hiện ở hình 3.34.
Hình 3.32. Kết quả thử hoạt tính sinh học của chất NEW 1
Hình 3.34. Kết quả thử hoạt tính sinh học của chất NEW 1
1 1 1 2 2 1 1 2 2
Trên mẫu 3 (Psedonala)
Kết quả thử hoạt tính sinh học trên chủng vi khuẩn Psedonala bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch đƣợc thực hiện ở phòng vi sinh, khoa Sinh học,Đại học Sƣ Phạm Đà Nẵng đƣợc thể hiện ở hình 3.33.
Trên mẫu 4 (Streptococcus)
Kết quả thử hoạt tính sinh học trên chủng vi khuẩn Streptococcus bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch đƣợc thực hiện ở phòng vi sinh, khoa Sinh học,Đại học Sƣ Phạm Đà Nẵng đƣợc thể hiện ở hình 3.35.
Hình 3.33. Kết quả thử hoạt tính sinh học của chất NEW 1
Hình 3.35. Kết quả thử hoạt tính sinh học của chất NEW 1
1 1 1 1 2 2 2 2 1
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và dữ liệu. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Mẫu 1 ( Salmonella) Mẫu 2 (E.Coli) Mẫu 3 (Psedonala) Mẫu 4 (Streptococcus) Dịch 1 +++ +-- +-- ++- Dịch 2 +++ --- --- --- Chú thích: +++: Kháng khuẩn mạnh +--: Kháng khuẩn yếu ---: không kháng khuẩn
- Dịch 1: 1g bột rễ cây ruốc cá trong 10 mL nƣớc. - Dich 2: 10 mL dung dịch chất NEW 1
Kết luận:
- Ở bột rễ cây ruốc cá có khả năng kháng khuẩn cả 4 vi khuẩn gây hại nhƣng vì nồng độ còn chƣa đủ lớn do đó vòng kháng khuẩn yếu.
- Ở chất Methyl Commate A phân lập đƣợc chỉ có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng Salmonella gây bệnh thƣơng hàn ở ngƣời. Còn những vi khuẩn còn lại không xuất hiện vòng kháng khuẩn.
-Vậy chất phân lập đƣợc có hoạt tính sinh học mạnh trên vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Salmonella.
- Dịch của bột rễ cây ruốc cá trong nƣớc có hoạt tính trong cả 4 vi khuẩn, nhƣng mạnh nhất trong Salmonella.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận thành phần hoá học
- Từ dịch chiết của 4 dung môi n-hexan, ethyl acetat, methanol, chloroform của bột rễ cây ruốc cá, bằng các phƣơng pháp chiết soxhlet chúng tôi đã xác định đƣợc thành phần của một số hợp chất có trong đó.
- Từ dịch chiết Chlorofom của bột rễ cây ruốc cá, bằng các phƣơng pháp sắc kí cột silicagel kết hợp với sắc kí lớp mỏng chúng tôi đã tách và xác định đƣợc cấu trúc của 1 hợp chất.
- Chất NEW 1: Methyl Commate A. Chất này đƣợc phân lập trƣớc đây từ loài Commiphora (chi Một dƣợc) ở Châu Phi và đƣợc xác định có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng (Bacillus subtilis), chống lại bệnh nấm.
Hoạt tính sinh học
- Từ kết quả thăm dò hoạt tính sinh học cho thấy hoạt chất NEW 1 có hoạt tính mạnh với Salmonella (Vi khuẩn gây bệnh thƣơng hàn).
2. Kiến nghị
Tiếp tục phân lập các phân đoạn còn lại của dịch chiết EtOAc, n-hexane và MeOH kết hợp với các phƣơng pháp phổ để xác định thành phần hoá học. Đồng thời thử hoạt tính sinh học của các chất tách đƣợc để có cái nhìn tổng thể về hoá thực vật cũng nhƣ hoạt tính sinh học của chi ruốc cá, góp phần làm tăng giá trị sử dụng của loài cây này trong y học và đời sống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
[1] Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống một số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.
[2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng và các tác giả (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
[3] Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, Việt Nam.
[4] Trịnh Đình Chính, Nguyễn Thị Bích Tuyết (2003), Giáo trình hợp chất tự nhiên, Huế.
[5] Phạm Hoàng Hộ (2000), “Cây Cỏ Việt Nam”, Nhà xuất bản Trẻ [6] Nguyễn Thị Thu Lan (2007), Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Huế.
[7] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Các phương pháp cô lập hợp chất tự nhiên, NXB ĐHQG Tp. HCM.
[8] Nguyễn Đình Triệu (2007), Các phương pháp phổ trong hóa học hữu cơ và hóa sinh, NXB Đại học quốc gia Hà Nội.
TIẾNG ANH
[9] Alírica I. Suárez, Beth Diaz M., Franco Delle Monache, Reinaldo S. Compagnone (2003), “Biflavonoids from Podocalyx loranthoides”, Fitoterapia 74, 473–475.
[10] Bagla, Victor P; McGaw, Lyndy J; Elgorashi, Esam E; Eloff, Jacobus N (2014), “Antimicrobial activity, toxicity and selectivity index of two biflavonoids and a flavone isolated from Podocarpus henkelii (Podocarpaceae) leaves”, BMC Complementary and Alternative Medicine 14(1), 383-389.
[11] Bai-Ping Ying, Isao Kubo (1993), “Norditerpene dilactones from podocarpus nagi”, Phytochemistry 34(4), 1107- 1110.
[12] Bai-Ping Ying, Isao Kubo, Chairul Takeshi Matsumoto, Yuji Hayashi (1990), “Congeners of norditerpene dilactones from podocarpus nagi”,
Phytochemistry 29(12), 3953-3955.
[13] Carlos Alberto Carbonezi, Lidilhone Hamerski, A. A. Leslie Gunatilaka, Alberto Cavalheiro, Ian Castro-Gamboa, Dulce Helena Siqueira Silva, Maysa Furlan, Maria Claudia Marx Young, Marcia Nasser Lopes, Vanderlan da Silva Bolzani (2007), “Bioactive flavone dimers from Ouratea multiflora (Ochnaceae)”, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 17(3), 319-324.
[14] Chang-Ming Sun, Wan-Jr Syu, Yi-Tsau Huang, Chien-Chih Chen and Jun- Chih Ou (1997), “Selective Cytotoxicity of Ginkgetin from c Selaginella moellendorffii”, J. Nat. Prod 60, 382-384.
[15] Cheng, K.T., Hsu, F.L., Chen, S.H., Hsieh, P.K., Huang, H.S., Lee, C.K., Lee, M.H. (2007), “New constituent from Podocarpus macrophyllus var. macrophyllus shows antityrosinase effect and regulates tyrosinase-related proteins and mRNA in human epidermal melanocytes”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 55, 757–761.
[16] D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker, K. D. Paull, A. Monks, S. Tierney, T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff, M. R. Boyd (1988), “Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines” Cancer Research 48, 4827-4833.