5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.3. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất
a. Điều chế các cao chiết
Lấy 3 kg bột rễ cây ruốc cá, ngâm với 20 lít dung dịch methanol trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ.
Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, rồi đem cất quay chân không dƣới áp suất thấp để đuổi bớt dung môi. Phần dung môi thu đƣợc sau cô quay tận dụng để chiết tiếp lần sau. Sau đó, đuổi hết dung môi thu đƣợc 100g cao methanol.
Hòa cao methanol với khoảng 50 mL nƣớc cất rồi chiết phân đoạn bằng phễu chiết lần lƣợt với hexane, chloroform và ethyl acetat (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Cặn từ dịch chiết hexane (44g), chloroform (26g), ethyl acetat (18,1g).
Quy trình điều chế các cao chiết đƣợc trình bày ở Hình 2.11.
Cao etyl axetat (18,1g) Cao chloroform (26g) Dịch chiết methanol Cao hexane (44g) Bã còn lại Bã còn lại Bã còn lại Cao methanol (100g)
- Ngâm chiết methanol (3 lần/ 24 giờ) - Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, gộp lại.
-Cất quay chân không thu hồi dung môi.
- Hòa cao methnol với 50 mL nƣớc cất - Chiết phân đoạn với 600 mL hexane, 3 lần.
- Chiết phân đoạn với 600 mL ethyl acetat, 3 lần.
- Chiết phân đoạn với 600 mL chloroform, 3 lần.
Bột rễ cây ruốc cá (3 kg)
b. Chạy cột sắc kí phần cao chloroform
Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho hệ dung môi n–hexane/EtOAc (5:3) vào cốc 500 mL (lựa chọn dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lấy 800 gam silicagel (Merck, 0,063 – 0,2 mm) cho vào cốc trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
- Cho một lƣợng nhỏ bông vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
- Silicagel đƣợc cho vào cột ở dạng sệt nhƣ Hình 2.14.
Phần cao chloroform tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel và pha động là các hệ dung môi n-hexane/EtOAc (5:3), n-hexane/Aceton (5:3), n-hexane/ EtOAc (1:2,5). Quy trình đƣợc trình bày ở hình 2.13.
Chuẩn bị cột sắc kí
- Cho hệ dung môi n–hexane/EtOAc (5:3) vào cốc 500 mL (lựa chọn hệ dung môi dựa vào sắc kí lớp mỏng).
- Lấy 800 gam silicagel (Merck, 0,063 – 0,2 mm) cho vào cốc trên và khuấy đều để đuổi hết bọt khí.
Cao chloroform 15g
SKC silicagel
n-hexane/EtOAc (5:3) Thu đƣợc 15 phân đoạn
C.9 1,83g
SKC silicagel
n-hexane/Axeton (5:3) Thu đƣợc 6 phân đoạn
C.9.4 0,72g
SKC silicagel
n-hexane/EtOAc (1:2,5) Thu đƣợc 5 phân đoạn
NEW1 0,07g Đo phổ để xác định cấu trúc Thử hoạt tính sinh học
- Cho một lƣợng nhỏ bông vào đáy cột (để tránh silicagel lọt xuống bình hứng).
Nạp mẫu vào cột
- Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp ƣớt.
- Mẫu ƣớt đƣợc cho vào cột sắc kí từ từ thông qua phễu và đũa thủy tinh sau khi đã khoá cột.
Chú ý: Khi cho mẫu vào cột theo phương pháp ướt thì lượng dung môi phải vừa đủ, không nhiều quá; lượng mẫu phải dàn trải đều một lớp mỏng trên bề mặt silicagel trong cột; mẫu phải thấm ướt đều dung môi, không có bọt khí.
- Sau đó cho một lớp silicagel bảo vệ mỏng ở phía trên mẫu.
Chạy cột Silicagel với hệ dung môi n–hexane/EtOAc với hệ dung môi ban đầu n–hexan/EtOAc (5:3), thu đƣợc 15 phân đoạn kí hiệu từ C.1 đến C.15.
Các phân đoạn đƣợc kiểm tra trên sắc kí bản mỏng cho thấy phân đoạn C.9 (1,83 g) cho các vệt rõ ràng. Do vậy, phân đoạn này đƣợc chọn để tiếp tục tách chất.
Hình 2.14. Mẫu được nạp vào cột
Phân đoạn C.9 (1,83 g) sau để cho bay hơi tự nhiên.Kiểm tra lại hệ bằng sắc kí bản mỏng và đƣợc hệ tiếp theo là n-hexan/Axeton (5:3).
Nạp mẫu lên cột silicagel, sau đó xả cột thu đƣợc 6 phân đoạn. Phân đoạn
C.9.4 (0,72g) sau khi đƣợc bay hơi tự nhiên tiếp tục tách chất trên cột silicagel với
dung môi chạy cột là n-hexan/EtOAc (1:2,5), sau đó xả cột thu đƣợc 5 phân đoạn. Ở phân đoạn C.9.4.3 (0,07g), chấm bản mỏng với hệ dung môi n-
hexan/EtOAc(1:2,5) thì thấy chỉ xuất hiện 1 vệt, chiếu đèn UV và hiện thuốc thử H2SO4 10% chỉ cuất hiện một màu vàng nhạt. Chất này đƣợc kí hiệu là NEW 1.