* Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ẩm ở 1000C đến khối lượng không đổi.
* Cơ sở của phương pháp
Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w.
Độ ẩm tương đối () của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
.100 m m ) m (m .100 w m w .100 m w ω 1 2 0 (2.1)
Trong đó, m: khối lượng chung của nguyên liệu(g).
mo: khối lượng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm) (g). w: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (g).
m1: khối lượng chén sứ (g).
m2: khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (g). Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu.
(%) = 3 (%) 3 1 * Cách tiến hành
Để xác định độ ẩm của hạt mù u tươi, chúng tôi tiến hành như sau: Chuẩn bị sẵn 3 chén sứ sạch, đánh dấu và sấy trong tủ sấy đến nhiệt độ 1000C. Sau khi sấy xong, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng, cân các chén sứ ta được khối lượng m1.
Cho vào mỗi chén sứ m g hạt mù u tươi. Sau đó, tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ như vậy đến khi khối lượng m2 của mẫu và chén không đổi thì cho vào bình hút ẩm để làm nguội.
Độ ẩm của mỗi mẫu được tính theo công thức (2.1) 2.3.1.2. Xác định hàm tro
* Nguyên tắc
Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hoá mẫu: Tro hoá hoàn toàn mẫu ở nhiệt độ 5000C khoảng 8 giờ.
* Tiến hành
Từ 3 mẫu hạt mù u tươi vừa được xác định độ ẩm ở thí nghiệm trên, đem đi tro hoá ở 5000C trong 8 giờ cho đến khi tro có màu trắng. Lấy mẫu ra làm nguội mẫu trong bình hút ẩm và cân lại mẫu để xác định hàm tro .
* Cách xác định
Khối lượng tro là khối lượng mẫu sau khi tro hóa. Hàm lượng tro được tính theo công thức (2.2). T(%) = 3 1 100% m m m (2.2) T trung bình (%) = 3 H % 3 1 Trong đó: m1: Khối lượng chén sứ (g)
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g) m: Khối lượng hạt mù u tươi(g)
T (%): Hàm lượng tro
2.3.2. Chiết tách dầu mù u bằng phương pháp ép cơ học
* Cách tiến hành: Lấy khoảng 100 gam mẫu hạt mù u đã sấy khô cho vào máy ép ly tâm. Khởi động cho máy chạy với tốc độ lớn. Các lưỡi dao gắn ở mâm xay sẽ mài nhỏ dần hạt mù u và tách phần lỏng ra khỏi phần bã nhờ lực ly tâm. Phần lỏng này bao gồm dầu, nước và một ít nhựa được chảy ra từ các khe nhỏ trên mâm xay tới bộ phận hứng dầu. Lấy phần bã rắn được tập trung ở khay đựng bã tiến hành ép lại đến khi không thấy dầu thoát ra nữa thì dừng lại. Lấy dầu thu được để lắng cạn, đem lọc trên giấy lọc thu được dầu mù u thô có màu vàng sánh mùi thơm nhẹ. Chiết trên phễu chiết để loại bỏ nước, và làm khan dầu thu được bằng Na2SO4. Cân xác định khối lượng dầu mù u thu được. Tiến hành thực nghiệm này 3 lần riêng biệt. Ghi các kết quả và tính toán hàm lượng dầu thu được theo công thức (2.3).
Khối lượng dầu được tính bằng công thức: m = m4 – m3
Hàm lượng dầu được tính theo công thức : X(%) = .100
0 3 4 m m m (2.3) Trong đó : mo: Khối lượng hạt mù u khô đem đi ép (gam).
m3: Khối lượng cốc thuỷ tinh (gam).
m: Khối lượng dầu mù u (gam) X(%): Thành phần % dầu mù u.
Dầu thu được sau khi đã làm sạch đem chạy sắc kí khí ghép khối phổ GC- MS để xác định hàm lượng cấu tử trong dầu mù u và thử hoạt tính kháng sinh của dầu mù u này.
2.3.3. Trích ly dầu mù u bằng phương pháp chiết soxhlet
2.3.3.1. Cơ sở của phương pháp chiết soxhlet
Chiết soxhlet là phương pháp chiết liên tục trên thiết bị chiết soxhlet. Dung môi được đun nóng trong bình cầu cho hơi dung môi đi lên bình chiết chứa chất qua ống sinh hàn ngược rồi ngưng tụ lại chảy vào bình chiết. Dung môi lựa chọn phải hoà tan chất hữu cơ nghiên cứu hoặc hoà tan chất phụ rồi qua ống nhánh chảy trở lại bình cầu. Nếu dung môi hoà tan chất phụ thì chất hữu cơ rắn còn lại trên bình chiết lấy ra làm khô. Nếu dung môi hoà tan chất hữu cơ thì thu được dung dịch chất hữu cơ trong bình cầu và tinh chế theo các phương pháp thông thường.
2.3.3.2. Chiết soxhlet hạt mù u bằng dung môi n-hexan
Lấy khoảng 10g mẫu hạt mù u khô, cho vào giấy lọc, quấn kĩ rồi bỏ vào dụng cụ chiết soxhlet. Tiến hành chiết trong 6 giờ bằng dung môi n-hexan, thu được dịch chiết, đem lọc bỏ bã chiết. Tiến hành chạy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS dịch chiết thu được để xác định hàm lượng cấu tử trong dịch chiết.
2.3.3.3. Chiết soxhlet hạt nhân quả mù u bằng dung môi chloroform
Lấy khoảng 10g mẫu hạt mù u khô, cho vào giấy lọc, quấn kĩ rồi bỏ vào dụng cụ chiết soxhlet. Tiến hành chiết trong 6 giờ bằng dung môi chloroform, thu được dịch chiết, đem lọc bỏ bã chiết. Tiến hành chạy sắc kí khí ghép khối phổ GC- MS dịch chiết thu được để xác định hàm lượng cấu tử trong dịch chiết.
2.3.3.4. Chiết soxhlet mẫu hạt mù u bằng dung môi ethanol
Lấy khoảng 10g mẫu hạt mù u khô, cho vào giấy lọc, quấn kĩ rồi bỏ vào dụng cụ chiết soxhlet. Tiến hành chiết trong 6 giờ bằng dung môi ethanol, thu được dịch chiết, đem lọc bỏ bã chiết. Tiến hành chạy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS dịch chiết thu được để xác định hàm lượng cấu tử trong dịch chiết.
2.3.4. Khảo sát điều kiện chiết tối ưu
2.3.4.1. Lựa chọn dung môi
Sau khi xác định thành phần hoá học trong các dịch chiết thu được với dung môi n-hexan, chloroform và ethanol bằng cách chạy sắc kí khí ghép khối phổ GC- MS. Dựa vào thành phần hoá học, chọn dung môi chiết tối ưu nhất là dung môi chiết được nhiều cấu tử chính nhất. Tiến hành khảo sát điều kiện chiết tối ưu với dung môi vừa chọn.
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết
* Cách tiến hành
Cân 5 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 gam hạt mù u khô. Tiến hành chiết soxhlet các mẫu này trong các thời gian khác nhau: 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ ở 700C trong cùng một lượng dung môi chiết nhất định, thu được các dịch chiết tương ứng.
Lần lượt cô đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không. Cốc thuỷ tinh chịu nhiệt 50 ml rửa sạch, sấy khô, đem cân, ghi lại số liệu rồi cho phần dịch sau khi cô quay vào cốc này. Sau đó cho vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ thích hợp thu được dầu mù u. Lấy cốc ra làm nguội. Tiến hành cân lại các cốc và mẫu sau khi sấy, ghi lại kết quả. Sau đó tính toán khối lượng dầu thu được trong từng thời gian chiết ở trên để xác định thời gian chiết tối ưu nhất.
Hàm lượng dầu được tính theo công thức (2.4).
Khối lượng dầu được tính bằng công thức: m = m4 – m3
Hàm lượng dầu được tính theo công thức : X(%) = .100
0 3 4 m m m (2.4) Trong đó : mo: Khối lượng hạt mù u khô đem đi chiết (gam).
m3: Khối lượng cốc thuỷ tinh (gam).
m4: Khối lượng cốc thuỷ tinh và dầu (gam). m: Khối lượng dầu mù u (gam)
2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ rắn(g)/lỏng(ml)
* Cách tiến hành
Cân 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 gam mẫu hạt mù u khô. Tiến hành chiết soxhlet các mẫu này trong các lượng thể tích dung môi chiết khác nhau: 100ml, 110ml, 120m, 130ml, 140ml, 150ml trong cùng thời gian 6 giờ, thu được các dịch chiết tương ứng.
Lần lượt cô đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không. Cốc thuỷ tinh chịu nhiệt 50 ml rửa sạch, sấy khô, đem cân, ghi lại số liệu rồi cho phần dịch sau khi cô quay vào cốc này. Tiến hành cân lại các cốc và mẫu sau khi sấy, ghi lại kết quả. Sau đó tính toán khối lượng dầu thu được từng thể tích khác nhau để xác định tỉ lệ rắn/lỏng tối ưu.
Hàm lượng dầu được tính theo công thức (2.5).
Khối lượng dầu được tính bằng công thức: m = m4 – m3
Hàm lượng dầu được tính theo công thức : X(%) = .100
0 3 4 m m m (2.5) Trong đó:
mo: Khối lượng hạt mù u khô đem chiết (gam). m3: Khối lượng cốc thuỷ tinh (gam).
m4: Khối lượng cốc thuỷ tinh và dầu (gam). m: Khối lượng dầu mù u (gam)
X(%): Thành phần % dầu mù u.
2.3.4.4. Trích ly dầu mù u bằng quy trình chiết tối ưu
* Cách tiến hành: Chúng tôi tiến hành trích ly dầu mù u với quy trình chiết tối ưu đã được xây dựng ở trên. Tiến hành trích ly 3 mẫu độc lập, cân xác định khối lượng dầu thu được và tính toán hàm lượng dầu thu được.
Hàm lượng dầu được tính theo công thức (2.6).
Khối lượng dầu được tính bằng công thức: m = m4 – m3
Hàm lượng dầu được tính theo công thức : X(%) = .100
0 3 4 m m m (2.6)
Trong đó :
mo: Khối lượng hạt mù u khô đem đi chiết (gam). m3: Khối lượng cốc thuỷ tinh (gam).
m4: Khối lượng cốc thuỷ tinh và dầu (gam). m: Khối lượng dầu mù u (gam)
X(%): Thành phần % dầu mù u.
2.3.5. Xá c đi ̣nh các chỉ số vật lý, hóa học của dầu mù u
2.3.5.1. Xá c đi ̣nh tỉ khối * Dụng cụ và hóa chất * Dụng cụ và hóa chất
- Bình đo tỉ trọng. - Cân phân tích. - Nước cất. - Axeton.
- Dầu mù u trích ly bằng dung môi tốt nhất đã lựa chọn để khảo sát điều kiện chiết tối ưu.
* Cách tiến hành
Rửa sạch bình đo tỉ trọng, tráng kĩ bằng nước cất, tráng lại bằng axeton, sấy khô trong tủ sấy. Để nguội bình rồi đem cân, ta xác định được khối lượng bình m (g).
Cho nước cất đến cổ bình, nút bằng ống mao quản. Đặt bình vào môi trường có nhiệt độ 250C, giữ trong khoảng 20 – 30 phút để cho nhiệt độ trong bình ổn định ở 250C. Lấy bình ra, lau khô bên ngoài bình, cân khối lượng của bình và nước, trừ đi khối lượng ban đầu của bình ta được khối lượng của nước cất chứa trong bình tỉ trọng, ký hiệu là m1 (g).
Tương tự ta được khối lượng dầu mù u, ký hiệu là m2 (g).
Tỉ trọng dầu mù u được tính theo công thức: d = m2 /m1 (2.7) Trong đó: m1, m2 lần lượt là khối lượng nước cất và dầu cùng thể tích.
2.3.5.2. Xác định chỉ số khúc xạ * Dụng cụ và hóa chất * Dụng cụ và hóa chất
- Khúc xạ kế WAY – S ABBE. - Axeton.
- Nước cất.
- Dầu mù u trích ly bằng dung môi tốt nhất đã lựa chọn để khảo sát điều kiện chiết tối ưu.
* Cách tiến hành
Đầu tiên bật máy, đặt ở nhiệt độ ổn định là 290C, chờ đến khi nhiệt kế chỉ 290C thì bắt đầu đo. Trước hết rửa sạch mặt lăng kính bằng axeton, để khô. Nhỏ một giọt nước cất lên mặt lăng kính, chỉnh thô và chỉnh tinh cho đến khi ta thấy được nửa sáng tối, và chỉ số khúc xạ của nước là 1,333. Lặp lại thao tác, mở nắp lăng kính, rửa sạch bằng axeton, để khô. Nhỏ một giọt dầu lên bề mặt lăng kính. Đọc chỉ số tương ứng với các vạch đo.
Tiến hành như vậy trong 3 lần. Sau đó ghi lại chỉ số khúc xạ, rồi lấy giá trị trung bình.
Sau khi đo chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ 290C, có thể chuyển về 250C theo biểu thức: 25 D n = n’+ r (t’–25) (2.8) Trong đó: - n’: chỉ số khúc xạ thí nghiệm - t’: nhiệt độ thí nghiệm.
- r: là hệ số hiệu chỉnh chỉ số khúc xạ khi nhiệt độ thay đổi 10C (r = 0,0005).
2.3.5.3. Xác định chỉ số axit
* Cách tiến hành: Cho m (gam) dầu mù u và 10ml rượu C2H5OH 960 vào bình cầu, lắc đều và cho tiếp vài giọt phenolphatalein vào bình cầu. Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N trong rượu đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 30 giây. Đọc kết quả thể tích dung dịch KOH (ml).
m V
Ax 5,61.
(2.9)
Trong đó:
- V: thể tích dung dịch KOH 0,1N/rượu dùng để chuẩn độ. - m: khối lượng dầu dùng để xác định.
- 5,61(mg): là lượng KOH có trong 1ml dung dịch rượu (nồng độ KOH đúng bằng 0,1N).
2.3.5.4. Xác định chỉ số este
* Cách tiến hành: Sau khi xác định chỉ số axit cho thêm 10 ml dung dịch KOH 0,5N trong rượu. Lắp ống sinh hàn không khí và đun cách thuỷ cho sôi hỗn hợp trong 1 giờ. Sau đó để nguội và chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,5N, đọc thể tích HCl (V1 ml).
Tương tự thay dầu bằng lượng nước cất tương ứng và tiến hành như trên, đọc thể tích HCl (V2 ml).
Chỉ số este được tính theo công thức (2.10).
m V V Es( 2 1).28,05 (2.10) Trong đó:
- V1: là số ml dung dịch HCl 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm - V2: là số ml dung dịch HCl 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu kiểm chứng - m: khối lượng dầu dùng để xác định
2.3.5.5. Xác định chỉ số xà phòng
Chỉ số xà phòng hóa là tổng của hai chỉ số axit và chỉ số este Chỉ số xà phòng hóa = Ax + Es
2.3.6. Phương pháp vi sinh vật thăm dò hoạt tính sinh học
Dầu mù u thu được theo phương pháp ép cơ học được chúng tôi đem thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Phòng thử hoạt tính sinh học phòng 602 nhà A 18 Viện hóa học Việt Nam. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC, IC50, MBC.
* Đối tượng thử: các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh.
- Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum.
- Vi khuẩn Gr (-): Salmonella enterica, Pseudomonasaeruginosa, Escherichia coli.
- Nấm: Candida albicans.
* Cách tiến hành
- Pha loãng mẫu thử: mẫu thử ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mụch đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.
- Thử hoạt tính: lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 370C/24h.
- Xử lí kết quả: Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. Giá trị MBC được xác định số khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành thực nghiệm theo sơ đồ như hình 2.2.
2.4. Sơ đồ nghiên cứu
Chiết với các dung môi khác nhau
Dịch chiết chứa cấu tử nhiều nhất
Khảo sát điều kiện chiết tối ưu: thời gian, tỉ lệ rắn/lỏng. Xác định độ ẩm, hàm lượng tro cloroform ethanol n-hexan Xác định chỉ số vật lí, hoá học Xác định thành phần hóa học (đo GC - MS)