2.6.1. Quy trình theo dõi nồng độ carbamazepin, acid valproic và phenytoin trong trị liệu
2.6.1.1. Phương pháp đo nồng độ thuốc trong máu
Định lượng bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (Fluorescence Polarization Immunoassay Assay - FPIA) trên hệ máy Centaur XP – Đức, thuốc thử là bộ Kit phân tích tự động được cung cấp bởi hãng Siemens (Đức).
Nguyên tắc:
Thuốc có đánh dấu huỳnh quang + kháng thể đặc hiệu phức hợp làm phân cực ánh sáng huỳnh quang.
Thuốc trong mẫu máu cần đo cạnh tranh làm giảm lượng phức hợp thay đổi độ phân cực của ánh sáng huỳnh quang.
Độ thay đổi tỷ lệ với lượng thuốc có trong mẫu máu.
2.6.1.2. Quy trình đo nồng độ thuốc trong máu
Bước 1: lấy mẫu
Máu được lấy khi nồng độ thuốc đạt trạng thái cân bằng (5 lần T1/2).
Đo nồng độ đáy: lấy mẫu ở 0-30 phút trước khi dùng liều tiếp theo.
Đo nồng độ đỉnh: tùy loại thuốc và dạng bào chế, tuy nhiên không áp dụng đối với thuốc đang nghiên cứu.
Vị trí lấy mẫu: tĩnh mạch khuỷu tay và tĩnh mạch cánh tay trong.
Thể tích mẫu: 2-3 mL.
Bước 2: Xử lý mẫu
– Mẫu máu (3 mL máu tĩnh mạch) sau khi lấy được cho vào ống nghiệm có chất chống đông heparin và gởi lên khoa Sinh hóa huyết học của bệnh viện.
– Ly tâm 3000 vòng/phút tách lấy huyết tương.
Huyết tương được tách ra cho vào ống nghiệm nút kín, có dán nhãn, mã hóa và được định lượng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ thích hợp (-20 oC) nếu không định lượng được ngay.
Bước 4: Định lượng nồng độ thuốc
Chuẩn hóa máy TDx Analyser
Tiến hành đo nồng độ thuốc trong huyết tương
Ghi nhận kết quả.
Bảng 2.6. Cách lấy mẫu máu đo nồng độ cho từng thuốc nghiên cứu
Thông tin CBZ VAL PHT
Tổng nồng độ (không gắn kết + gắn kết) 4-12 μg/mL 50-100 μg/mL 10-20 μg/mL Nồng độ PHT tự do: 1- 2 μg/mL
Thời điểm lấy mẫu
Đo nồng độ đáy
Ngay trước liều đầu tiên vào buổi sáng
Đo nồng độ đáy
Ngay trước liều đầu tiên vào buổi sáng
Đo nồng độ đáy
Ngay trước liều đầu tiên vào buổi sáng
Những trường hợp không cấp tính
Mẫu thử được lấy 3-4 tuần sau khi uống
Mẫu thử được lấy 2-4 ngày sau khi uống
Mẫu thử được lấy 7-10 ngày sau khi uống
Lấy mẫu trong trường hợp đặc biệt
Mẫu thử được lấy 2-4 ngày sau khi bắt đầu điều trị nhằm điều chỉnh chế độ liều
Đối với BN nặng
Lần 1: mẫu thử được lấy lần đầu tiên trong khoảng từ 2-3 ngày.
Lần 2: mẫu thử được lấy lần đầu tiên trong khoảng từ 3-5 ngày sau lần 1
Nếu nồng độ thuốc ổn định từ 3-5 ngày, theo dõi sau mỗi tuần Điều trị lâu dài Lấy mẫu theo dõi
mỗi 3-12 tháng
Lấy mẫu theo dõi mỗi 3-12 tháng
Lấy mẫu theo dõi mỗi 3-12 tháng
2.6.2. Quy trình khảo sát tính đa hình của CYP
2.6.2.1. Phương pháp xác định đột biến CYP
Xác định vị trí đa hình gen theo phương pháp real-time polymerase chain reaction với kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) được chạy trên thiết bị Real-time PCR, dòng Mx3005P™ - Agilent với đoạn mồi và primer phù hợp, chạy trên máy Rotorgene 6000/Q (Corbett, Research, Qiagen) nhằm tìm các đột biến trên exon ở nhiễm sắc thể số 10 có gen mã hóa cho enzym CYP.
Nguyên tắc: kiểu gen được xác định dựa trên sự khác biệt điểm chảy đặc hiệu trên đường cong điểm chảy của gen gốc và gen đột biến, theo các bước sau:
Thực hiện biến tính mẫu thuốc thử và hoạt hóa enzym
Khuếch đại đoạn ADN đích bằng phương pháp PCR
Phân tích đường cong nóng chảy xác định sản phẩm PCR từ ADN đích
Làm lạnh hệ thống
2.6.2.2. Quy trình lấy mẫu máu ban đầu và bảo quản
Vị trí lấy mẫu: tĩnh mạch khuỷu tay và tĩnh mạch cánh tay trong
Thể tích mẫu: 4 mL mẫu máu tươi (ổn định trong EDTA) được bảo quản ở
nhiệt độ phòng (18-25 oC) trong 2-3 giờ hoặc ở nhiệt độ 4-8 oC trong vòng 24 giờ, bảo quản mẫu trong vòng 1 tháng (ở -20 oC) và 1 năm (ở -80 oC).
- Ly tâm tách lấy huyết tương từ máu và bảo quản lạnh trong vòng 1 tháng (ở - 20 oC) và 1 năm (ở -80 oC).
2.6.2.3. Tách chiết ADN bộ gen từ mẫu
Nguyên tắc: kết hợp các chất ly giải hiệu quả vật liệu ban đầu, không hoạt hóa các DNases, protein trong dung dịch ly giải được phân hủy với proteinase K. ADN tự do được gắn vào màng lọc “RTA Spin Filter”. Các chất gây nhiễm được loại bỏ bằng nhiều bước rửa và ADN tinh sạch có thể được hoà tan với một lượng nhỏ đệm rửa “Elution Buffer” và sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -80°C. Sử dụng bộ công cụ chiết tách Invisorb® Spin Universal Kit.
Các bước thực hiện: Bước 1: ly giải mẫu
Mẫu được ly giải trong điều kiện biến tính với nhiệt độ tăng dần. Với điều kiện biến tính mạnh có sự hiện diện của proteinase K và đệm ly giải “Lysis Buffer HL”, tế bào bị phá vỡ dễ dàng và các DNase bị bất hoạt ngay lập tức, do đó, ADN mẫu không bị ảnh hưởng. Lượng ARN mang (carrier ARN) được thêm để tăng khả năng thu hồi ADN mẫu, vì vậy một lượng ADN mẫu nhỏ cũng có thể được tinh sạch. “Carrier ARN” cũng ổn định acid nucleic trong mẫu với nồng độ acid nucleic rất nhỏ.
Bước 2: gắn mẫu vào màng lọc RTA Spin Filter
Thêm đệm gắn (Binding Buffer HL) để tối ưu hoá việc gắn ADN mẫu vào màng RTA Spin Filter.
Sau đó, dung dịch đã ly giải sẽ được đưa lên màng RTA Spin Filter và DNA mẫu sẽ gắn vào bề mặt của màng RTA Filter, trong khi đó, phần dịch sau ly giải sẽ đi qua màng nhờ ly tâm.
Bước 3: rửa sạch màng, loại bỏ các chất gây nhiễm và ethanol
Các chất tạp nhiễm được rửa sạch bằng dung dịch rửa (Wash Buffer I và Wash Buffer II), trong khi ADN mẫu vẫn còn được gắn trên màng RTA Spin Filter. Bước rửa được lặp lại nhiều lần đảm bảo các chất gây nhiễm và ức chế enzym được loại bỏ một cách hiệu quả.
Bước 4: tinh sạch ADN
Hòa tan ADN tinh sạch từ màng: ADN mẫu có độ tinh sạch cao được hoà tan khỏi màng bằng đệm rửa (Elution Buffer). ADN mẫu thu được có thể sử dụng cho các ứng dụng tiếp sau.
2.6.2.4. Xác định đột biến gen bằng phương pháp real-time PCR
Sử dụng mẫu ADN đã tách chiết để xác định kiểu gen theo bộ kit (Genomic column DNA Express và SaMag Blood DNA Extraction Kit) được cung cấp từ Ý (Sacace Molecular Genetics).
Nguyên tắc: thực hiện việc khuếch đại một trình tự ADN đích bằng phản ứng real-time PCR từ các mẫu DNA người (phương pháp TaqMan).
Phản ứng PCR hoạt động với các mồi quanh đột biến, cũng như hai probe huỳnh quang, một probe đặc hiệu cho alen thường (hoang dại) và một probe đặc hiệu cho alen đột biến. Các probe được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang ở đầu 5’. Huỳnh quang được phân tích trong phản ứng real time hoặc ở điểm kết thúc, cho phép phân biệt các kiểu gen có thể có (đồng hợp tử bình thường, dị hợp tử, đồng hợp tử đột biến).
+ Khuếch đại đoạn gen chứa các đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism - SNPs) bằng phương pháp PCR:
Kiểu gen CYP được xác định bởi trình tự các alen theo kỹ thuật real-time PCR sử dụng bộ kit (CYP3A5 (G6986A) SNP–Screen - được cung cấp từ Ý (Sacace Molecular Genetics) với đoạn mồi phù hợp.
Bảng 2.7. Đặc điểm trình tự gen đoạn mồi các CYP
Gen Đoạn gen – độ dài Trình tự mồi
CYP3A5*3 G 6986 A rs776746 (121 bp) Mồi xuôi: 5’- GGCAACATGACTTAGACAG-3’; Mồi ngược: 5’- GGTCCAAACAGGGAAGAAATA - 3’
CYP2C9*2 Arg 144 Cys CGT 144 TGT
rs1799853
Mồi xuôi : 5’-biotin-
GTATTTTGGCTTGAAACCCATA-3’ Mồi ngược: 5’-
GGCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3’
CYP2C9*3 Ile 359 Leu ATT 359 CTT rs1057910 Mồi xuôi : 5’-biotinTGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’ Mồi ngược: 5’-ACAAACTTACCTTGGAATGAGA-3’
94oC 94oC
72oC 72oC 30 s 15 s
60oC
1 ph 30 s 2 ph 4oC
Để có quy trình nhân dòng đoạn gen chứa các SNP đặc hiệu và ổn định, chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu, nồng độ mồi tối ưu, nồng độ ADN tối ưu trong phản ứng.
Các thành phần trong phản ứng PCR với thể tích phản ứng là 25 µl:
Thành phần Thể tích
Taq Mix 12,5 µl
Oligo Mix 7,5 µl
Cho một trong 3 ADN mẫu sau: - ADN mẫu bệnh
- ADN chứng dương
- ADN chứng âm thay bằng nước
5 µl 5 µl 5 µl
Tổng thể tích phản ứng 25 µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
40 chu kì
Biểu đồ 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
+ Phân tích kết quả PCR:
Các biểu đồ khuếch đại được hiển thị trên màn hình Amplification Plot. Kết quả phát hiện các SNP của quá trình real time PCR được mở bằng phần mềm MxPro qPCR, qua đó xác định kiểu gen của BN.
2.6.3. Quy trình quy trình xét nghiệm gen HLA - B
Quy trình lấy mẫu máu và quy trình tách chiết ADN bộ gen từ mẫu được thực hiện như đã mô tả trong mục 2.5.2 (Quy trình khảo sát tính đa hình của của CYP).
Nguyên tắc: sự bắt cặp đặc hiệu giữa giữa đầu dò ADN (probe) trên các vi hạt (microbead) với sản phẩm ADN của mẫu xét nghiệm đánh dấu bằng huỳnh quang, trong đó các đầu dò ADN được thiết kế đặc hiệu cho từng alen HLA ở độ phân giải cao (High resolution). Tùy theo mật độ huỳnh quang tương ứng, hệ thống Luminex đọc và xác định được tên đầu dò đã gắn với chuỗi DNA của mẫu và kiểu gen HLA tương ứng.
Mỗi vi hạt được thiết kế sẵn sao cho chúng gắn kết với các đầu dò đã biết trước trình tự và một loại phẩm nhuộm. Phẩm nhuộm này có thể được phát hiện bằng ánh sáng huỳnh quang có cường độ nhất định. Trong phương pháp này, khoảng 100 vi hạt khác nhau đã được sử dụng. Tương ứng với đó là khoảng 100 loại đầu dò và khoảng 100 mức cường độ ánh sáng huỳnh quang khác nhau.
Mẫu ADN của BN cũng được gắn với một loại phẩm nhuộm khác. Nếu có sự bắt cặp đặc hiệu giữa ADN của BN và đầu dò, hai loại phẩm nhuộm trên sẽ phát tín hiệu bởi kích thích của hai loại ánh sáng lazer khác nhau.
Khi biết được loại vi hạt nào bắt cặp đặc hiệu được với mẫu ADN của BN, lúc đó có thể xác định được kiểu gen của BN vì trình tự của đầu dò đã được thiết kế từ trước.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Thiết lập phản ứng PCR để khuếch đại số lượng đoạn gen HLA từ mẫu ADN toàn phần.
Bước 2: Ly giải sản phẩm khuếch đại ở bước 1 từ chuỗi kép ADN thành chuỗi đơn ADN.
Bước 3: Trộn sản phẩm của bước 2 vào hỗn hợp các vi hạt để tạo sự bắt cặp đặc hiệu.
Bước 4: Trộn sản phẩm của bước 3 dung dịch SAPE (surelight streptavidin-R- phycoerythrin), để giúp các phẩm nhuộm có thể phát tín hiệu huỳnh quang dưới kích thích của ánh sáng la-ze.
Bước 5: Chuyển sản phẩm ở bước 4 vào đĩa 96 giếng với bộ Kit gồm mồi ADN (primer) đặc hiệu HLA, hệ đệm D - mix và đặt vào hệ thống Luminex, Bio Plex® của hãng Bio-Rad. Đọc kết quả từ phần mềm máy tính.