CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
Bảng 1. 1phân cực của các dung môi
Khả năng kháng khuẩn của cao Lô hội đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi
- ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).
1.4.1.1. Escherichia coli
Escherich là người đầu tiên phát hiện ra lồi vi khuẩn này trong q trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì lồi này kí sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ơng đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ơng báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakteriendes Säuglings und ihre Beziehungenzur Physiologie der Verdauung”.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria
- Lớp (Class): Gammaproteobacteria
- Bộ (Order): Enterobacteriales
- Họ (Family): Enterobacteriaceae
- Giống (Genus): Escherichia
- Loài (Species): E.coli
Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí khơng bắt buộc, vi
khuẩn có hình roi tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 21 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
Chúng thường khơng gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ.
Hình 1. 21: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển
Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn
E.coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số lồi có
thể di chuyển bằng roi, một số ít thì ở n một chỗ khơng có khả năng di động. Chúng khơng thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác.
Sinh trưởng ở 15 – 40nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37
thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn
7.4. Mọc tốt trên mơi trường ℃
lạc trịn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3 mm.
Độc tố:
- Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng.
- Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ tăng.
- Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể.
1.4.1.2. Bacillus cereus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bacillus cereus là lồi vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng
hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
Theo phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 22 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
- Ngành (Division): Firmicutes
-Lớp (Class): Bacilli
- Bộ (Order): Bacillales
- Họ (Family): Bacillaceae
- Giống (Genus): Bacillus
- Loài (Species): Bacillus cereus
Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0.5 – 1.5 x 2 – 4 mm. Vi khuẩn không tạo giáp mơ, khơng có khả năng di động
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Đặc điểm nuôi cấy :
Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 oC, tối ưu 35 – 40 oC, độ ph 4.5 – 9.3; thích hợp 7 – 7.2.
- Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
- Trên mơi trường BA tạo dung huyết rộng.
- Trên mơi trường MYP: khóm hồng chung quanh có vịng sáng.
- Trên mơi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vịng sáng.
- Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn.
Hình 1. 22: Vi khuẩn Bacillus cereus trên kính hiển vi
Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
- Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
- Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không
bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngồi ra vi khuẩn cịn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hịa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.
1.4.1.3. Salmonella
Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz
xác định Salmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bị và lách người bệnh, ơng gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Salmonella enteritidis.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria
- Lớp (Class): Gammaproteobacteria
- Bộ (Order): Enterobacteriales
- Họ (Family): Enterobacteriaceae
- Giống (Genus): Salmonella lignieres 1900
Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy
nghi, khơng tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0.7 µm đến 1.5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lơng rung hình roi. Phát triển tốt ở 6
thích hợp nhất là 7.2 . ở
Trên mơi trường phân lập
tâm đen, mơi trường chuyển sang màu vàng.
Hình 1. 23: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi
Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố:
- Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
- Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và ni cấy kị khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.
1.4.1.4. Staphylococcus aureus
Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ơng sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trị của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878,
phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học.
Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Eubacteria
- Ngành (Division): Firmicutes
- Lớp (Class): Bacilli
- Bộ (Order): Bacillales
- Họ (Family): Staphylococcaceae
- Giống (Genus): Staphylococcus
- Loài (Species): Staphylococcus aureus
Hình 1. 24: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các
cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, khơng di động, không sinh nha bào
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 25 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
và thường khơng có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong khơng gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đơi hoặc đám nhỏ.
Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ khơng khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.
Phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc℃Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh℃trưởng tối ưu của S.
aureus là 18 – 40 , pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 , hiếu khí hay kỵ khí tuỳ
ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở mơi trường đặc, khuẩn lạc trịn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S.aureus có thể sinh trưởng được trên mơi trường có hoạt độ thấp hơn các lồi vi khuẩn khác hoặc mơi trường có nồng độ muối cao.
Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở
℃
nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 tăng trưởng ở 35 – 37 .
Staphylococcus aureus có trong nhiều mơi trường sống trước đây, thường
sống ký sinh vơ hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus
aureus xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng
khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.
Độc tố - Enzym:
- Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
- Độc tố: Hầu hết các dòng℃ S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong mơi trường có nhiệt độ trên 15 hơn cả vi khuẩn.
- Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S.aureus℃ là một protein ổn định nhiệt,nhiều℃
nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37và có thể tồn tại nhiệt ở 100trong vịng 30 – 700 phút.
- Các enzyme ngoại bào:
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 26 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
• Protease phân giải protein của tế bào chủ.
• Lipase phân giải lipid.
• Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME).
1.4.1.5. Pseudomonas aeruginosa
Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống
Pseudomonas thành 92 lồi khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong số 12 loài có liên quan nhiều đến y học. Pseudomonas aeruginosa (P.
aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đơi và có khi xếp
thành chuỗi. Di động nhờ một lơng duy nhất ở một cực. Có pili, khơng bào tử. Phân loại khoa học:
- Giới (Kingdom): Bacteria
- Ngành (Division): Proteobacteria
- Lớp (Class): Gamma proteobacteria
- Bộ (Order): Pseudomonadales
- Họ (Family): Pseudomonas
- Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa
Hình 1. 25: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi
Sức đề kháng:
- Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hố.
- Có khả năng đề kháng kháng sinh cao.
Kháng nguyên:
- Kháng nguyên liên kết với tế bào:
+ Protein màng ngồi: các protein ở màng ngồi tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 27 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
+ Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủng P. aeruginosacó khuẩn lạc dạng M và dạng R.
- Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hố
trong mơi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch.
Phân loại trực khuẩn mủ xanh:
Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P.
aeruginosa. Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong
điều tra dịch tễ học q trình lây nhiễm lồi vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95 % số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type kháng nguyên O chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu
từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16).
Nội độc tố :
Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trị quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết.
Ngoại độc tố : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của
P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi
chức năng đơng máu, rối loạn chuyển hố lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 28 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
1.4.2. Phương pháp khuếch tán đĩa
Nguyên tắc: Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của
Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37 oC. Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường MHA đặc. Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5% thành các nồng độ theo yêu cầu.. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10 g/ml, Tetracyclin 30 g/ml, Amoxilin 10 g/ml); đối chứng âm là DMSO 5%. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo đường kính (DK) vịng ức chế vi sinh vật bằng cơng thức: DK (mm) = D - d; trong đó D = đường kính vịng vơ khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch (giếng).
Hình 1. 26: Đĩa petri có sẵn mơi trường và vi khuẩn