CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.5.Phương pháp định danh bằng sắc ký ghép khối phổ GC/MS
Hệ thống sắc ký khí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc ký khí nối với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bỏ khí mang N2, He để giảm áp suất của dịng áp suất của dịng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký dùng mao quản, phần khối phổ sử dùng buồng ion hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.
GC – MS bao gồm:
Sắc ký khí ( GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 29 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân khơng cao (10 – 6 mmHg). Sau q trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng và ghi nhận theo cường độ của các hạt đó. Dùng để xác định định định tính và định lượng.
Hình 1. 27: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động:
- Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí.
- Vỏ ngồi (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lị nung đặc biệt. nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320 oC.
- Cột (cloumn):
Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thơng tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 30 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
- Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính tốn các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.
Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ:
- Xác định cơng thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trong phổ đồ.
- Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử cũng như ion mảng.
- Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 31 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm Hố Dầu, Phịng nghiên cứu khoa học của ngành Cơng Nghệ Kỹ Thuật Hố Học và phịng thí nghiệm vi sinh của ngành Cơng Nghệ Thực Phẩm tại Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là cây Lô hội được lấy từ xã Long Phước, Bà Rịa. Nguyên liệu sau khi hái được đem rửa sạch và loại chất nhựa salext màu vàng. Phần lá được đem sấy khơ ở nhiệt độ 80 oC sau đó nghiền nhỏ. Hóa chất được sử dụng cho chiết tách và định tính thành phần hóa học trong Lơ hội:
Ethanol 96
Ethyl ether, Trung Quốc
Methanol, Trung Quốc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hexan, Trung Quốc
N – Butanol, Trung Quốc
HCl, Trung Quốc
2.1.3. Dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ thiết bị cần thiết cho ghiên cứu: Máy cô quay chân không
Máy lọc hút chân không
Máy khuấy từ gia nhiệt + cá từ Thiết bị chiết Soxhlet
2.1.4. Môi trường
Các chủng vi sinh được tăng sinh trong môi trường lỏng TSB:
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 32 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Bảng 2. 1: Môi trường Trypticase Soy Broth
Đun nóng, phân phối mơi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút ở121 .
Môi
trường đặc MHA dùng để đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phường pháp
℃
khuếch tán qua thạch:
Bảng 2. 2: Môi trường Mueller Hinton Agar
Đun để hoà tan℃ các thành phần trong nước cất. Điều chỉnh Ph = 7.4, hấp khử trùng 15 phút ở 121 . Rót ra đĩa petri.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Chiết cao vỏ lá Lô hội bằng phương pháp Soxhlet
Theo nguyên tắc, làm việc trên 1 yếu tố thí nghiệm cịn cố định các yếu tố còn lại, kết quả tốt nhất của thí nghiệm trước được rút ra làm thơng số cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Chỉ tiêu đánh giá là khối lượng cao được chiết với các dung mơi khác nhau.
Thí nghiệm xác định dung môi chiết:
Dung môi là yếu tố quan trọng nhất trong việc trích ly. Việc lựa chọn dung mơi có thể ảnh hưởng khối lượng cao được chiết.
Quy trình thực nghiệm chung:
Hình 2. 1: Sơ đồ khảo sát chiết cao vỏ lá Lơ hội bằng phương pháp Soxhlet
Thuyết mình quy trình:
- Bước 1: Cân 10 g vỏ lá Lơ hội. Chuyển tồn bộ ngun liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).
- Bước 2: Thêm 250 ml dung mơi (Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống soxhlet. Đun nguyên liệu trong 6 giờ.
- Bước 3: Thu được dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi. Bảo quản
cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, đậy kín, bảo quản trong tủ lạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bước 4: Cân khối lượng cao chiết của 6 dung môi và nhận thấy dung mơi
Ethanol có lượng cao nhiều sau Methanol (do Methanol có tính độc nên chọn dung mơi trích ly chiết cao là Ethanol).
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 34 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Hình 2. 2: Hệ thống chiết cao tại phịng thí nghiệm
Mục đích: Khảo sát nhằm thu hiệu suất cao vỏ lá Lô hội qua các hệ dung mơi và
định tính các thành phần có trong dịch chiết lá Lơ hội.
Kế hoạch: Chiết vỏ lá Lô hội bằng nhiều hệ dung mơi có độ phân cực khác nhau
(Ethyl, Ether, Methanol, Ethanol, Hexan) và tối ưu quy trình theo phương pháp soxhlet.
Thực nghiệm: Cân 10g vỏ lá Lô hội cho vào túi lọc và đặt vào bình chiết, thêm
dung mơi vào bình cầu sao cho dung mơi trong bình cầu khơng được nhiều hơn hai phần ba thể tích bình cầu. Lắp hệ thống Soxhlet và kiểm tra hệ thống, mở nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng, cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt cho dung mơi trong bình cầu sơi đều. Chiết trong thời gian 6h. Tháo hệ thống soxhlet, tiến hành lọc dịch chiết bằng máy lọc hút chân khơng, sau đó đưa đi cơ quay thu hồi dung mơi.
Thí nghiệm xác định nồng độ dung mơi Ethanol:
Nồng độ Ethanol ảnh hưởng đến sự phân tán và thấm thấu vào nguyên liệu để hoà tan các hợp chất hữu cơ cần thiết.
- Cố định thông số thời gian và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (đã khảo sát ở 2.2.1.2);
- Khảo sát các nồng độ Ethanol: 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 96%.
Thí nghiệm xác định tỉ lệ dung mơi/ngun liệu:
Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khơng phù hợp thì lượng cao vỏ lá Lơ hội thu được chưa hoàn toàn chiết kiệt hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung mơi q nhiều.
- Cố định thơng số thời gian (đã khảo sát ở 2.2.1.2);
- Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 15:1; 20:1; 25:1; 30:1; 35:1.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết:
Thời gian chiết có vai trị quyết định lượng cao vỏ lá Lô hội sau khi chiết. Nếu thời gian quá ngắn thì lượng cao Lơ hội được chưa hồn tồn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn thời gian, tổn hao năng lượng và các chất trong cao bị oxy hố biến tính.
- Dung mơi chiết: Ethanol;
- Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 25:1;
- Khảo sát các thông số thời gian 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h.
2.2.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong dịch chiết vỏ lá Lô hội Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid
Phản ứng Borntraeger Thực nghiệm:
Cho erlen chứa các dung dịch sau:
- Dịch ethanol - HCl 4N - FeCl3 20%
- Bột khô vỏ lá Lô hội 1 g
Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml. Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏ nước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nh . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:
- Thuốc thử Liebermann – Burchard: Anhidrid acetic 1 ml
H2SO4 đậm đặc
Dung dịch màu xanh lục.
- Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc.
Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung
dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm. Dung dịch màu xanh tím.
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
- Thuốc thử Wagner:
I2 KI H2O vừa đủ 100 ml
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiên ống và nhỏ từ từ từng
giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên. Có xuất hiện tủa màu nâu.
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Một số thuốc thử Flavnoid:
o Với dung dịch FeCl3 bão hòa:
Thực nghiệm : Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ
từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.
Dung dịch màu xanh đen.
o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến
xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng
giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút. Dung dịch màu vàng cam.
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
- Thuốc thử: HCl 0.1 N
NaOH 0.1 N
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 37 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
- Ống 2: 5 ml NaOH 0.1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.
- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin
steroid.
2.2.3. Định danh một số hợp chất tự nhiên trong cao Lô hội
Thành phẩm cao Lô hội (dịch chiết đã được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi mẫu ở dạng cao). Gửi mẫu đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh).
2.2.4. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao Lô hội
- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, mơi trường hoạt tính kháng khuẩn MHA.
- Độ đục chuẩn 0.5 MC Farland: tương ứng với 108 vi khuẩn/ml, sử dụng làm
độc đục chuẩn khi pha loãng dịch vi khuẩn. Cách pha: 0.5 ml BaCl2 0.048M + 99.5 ml H2SO4 0.19M.
- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
Cao Lô hội được pha trong dung dịch DMSO 5 % vô trùng với: 1600 mag/ml: 1.6 g Cao + 1 ml DMSO 5%;
800 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 1600 mg/ml + 1 ml DMSO 5%; 400 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%; 200 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%.
Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Chloramphenicol và Tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng.
- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA, đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch khơng bị nhiễm thì đem tăng sinh
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 38 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Mơi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.
Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha lỗng bằng nước cất vơ trùng đến độ đục tương đương 0.5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
Thực nghiệm:
Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1 đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch cao đã được pha theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml), đè nh để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).
Sau đó đem ni ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus
nuôi trong 24 giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vịng vơ khuẩn.
HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 39 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên
Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lô hội 3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lơ hội
Qua q trình thực nghiệm quy trình chiết cao vỏ lá Lơ hội bằng Soxhlet:
Kết quả thí nghiệm xác định dung mơi chiết:
Bảng 3. 1: Khối lượng cao vỏ lá Lô hội thu được từ 5 dung môi chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung mơi Thời gian
6h
Hình 3. 1: Biểu đồ ảnh hưởng của các dung môi đến hiệu suất cao chiết cao vỏ lá Lô Hội