Môi trường Mueller Hinton Agar

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

Bảng 2. 2 Môi trường Mueller Hinton Agar

Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Anthranoid

Phản ứng Borntraeger Thực nghiệm:

Cho erlen chứa các dung dịch sau:

- Dịch ethanol - HCl 4N - FeCl3 20%

- Bột khô vỏ lá Lô hội 1 g

Đun cách thuỷ trong 10 phút, để nguội và cho vào bình gạn dung tích 50 ml. Lắc với 5 ml ether. Gạn bỏ nước. Lớp ether được giữ lại để thực hiện phản ứng.

Lấy 1 ml dịch chiết ether cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm từ từ từng giọt đến hết 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nh .

 Dung dịch lớp kiềm có màu đỏ sim.

Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid

Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:

- Thuốc thử Liebermann – Burchard: Anhidrid acetic 1 ml

H2SO4 đậm đặc

 Dung dịch màu xanh lục.

- Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc.

Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung

dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.  Dung dịch màu xanh tím.

Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid

- Thuốc thử Wagner:

I2 KI H2O vừa đủ 100 ml

Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, nghiên ống và nhỏ từ từ từng

giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên.  Có xuất hiện tủa màu nâu.

Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid

Một số thuốc thử Flavnoid:

o Với dung dịch FeCl3 bão hòa:

Thực nghiệm : Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch chiết, nghiêng ống và nhỏ từ từ

từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.

 Dung dịch màu xanh đen.

o Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến

xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau.

Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng

giọt đến 1 ml H2SO4 đậm đặc, đun nóng trong 1 phút.  Dung dịch màu vàng cam.

Khảo sát sự hiện diện của saponin

Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:

- Thuốc thử: HCl 0.1 N

NaOH 0.1 N

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 37 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

- Ống 2: 5 ml NaOH 0.1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.

- Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.

- Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.

- Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin

steroid.

2.2.3. Định danh một số hợp chất tự nhiên trong cao Lô hội

Thành phẩm cao Lô hội (dịch chiết đã được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi mẫu ở dạng cao). Gửi mẫu đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh).

2.2.4. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao Lô hội

- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, mơi trường hoạt tính kháng khuẩn MHA.

- Độ đục chuẩn 0.5 MC Farland: tương ứng với 108 vi khuẩn/ml, sử dụng làm

độc đục chuẩn khi pha loãng dịch vi khuẩn. Cách pha: 0.5 ml BaCl2 0.048M + 99.5 ml H2SO4 0.19M.

- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:

Cao Lô hội được pha trong dung dịch DMSO 5 % vô trùng với: 1600 mag/ml: 1.6 g Cao + 1 ml DMSO 5%;

800 mg/ml: 1 ml dịch nồng độ 1600 mg/ml + 1 ml DMSO 5%; 400 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 800 mg/ml + 1 ml DMSO 5%; 200 mg/ml: 1 dịch ml nồng độ 400 mg/ml + 1 ml DMSO 5%.

Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng dương là Chloramphenicol và Tetracycline (1 mg/ml pha trong DMSO 5%), chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng.

- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:

Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA, đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch khơng bị nhiễm thì đem tăng sinh

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 38 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Mơi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.

Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha lỗng bằng nước cất vơ trùng đến độ đục tương đương 0.5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.

Thực nghiệm:

Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1 đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch cao đã được pha theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml), đè nh để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).

Sau đó đem ni ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus

nuôi trong 24 giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vịng vơ khuẩn.

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 39 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu

Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lô hội 3.1. Kết quả chiết tách cao vỏ lá Lơ hội

Qua q trình thực nghiệm quy trình chiết cao vỏ lá Lơ hội bằng Soxhlet:

Kết quả thí nghiệm xác định dung mơi chiết:

Bảng 3. 1: Khối lượng cao vỏ lá Lô hội thu được từ 5 dung môi chiết

Dung mơi Thời gian

Hình 3. 1: Biểu đồ ảnh hưởng của các dung môi đến hiệu suất cao chiết cao vỏ lá Lơ Hội

Nhận xét: Khả năng hịa tan của các chất có hoạt tính sinh học trong lá Lơ hội khác

nhau tùy thuộc vào loại dung mơi. Ở các thời gian khác nhau, thì dịch chiết thu được có thành phần các hợp chất hịa tan khác nhau.

Khi chiết vỏ lá Lơ hội với 5 dung môi khác nhau bằng hệ thống Soxhlet ở thời gian 6h với tỉ lệ dung mơi/ngun liệu là 25:1 thì lượng cao vỏ lá Lơ hội thu được cao nhất là chiết với dung mơi Methanol có khối lượng cao là 2.53 g (H = 25.3%). Dung mơi có lượng cao vỏ lá Lơ hội cũng khơng kém Methanol là Ethanol 96% có lượng cao là 2.37g (H = 23.7%). Lượng cao vỏ lá Lô hội thu được thấp nhất

Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu

Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học

khi chiết với Hexan có khối lượng cao là 0.47 g (H = 4.7 %). Hai dung mơi cịn lại là Ethyl Acetat (H = 7.3%) có hiệu suất cao hơn dung mơi Hexan (H = 5.6%)

Kết quả thí nghiệm xác định nồng độ dung môi Ethanol

Bảng 3. 2: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với dung môi Ethanol ở các nồng độ khác nhau

Dung mơi Ethanol Khối lượng

cao (g)

Hình 3. 2: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ Ethanol đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội

Nhận xét: Khi chiết vỏ lá Lô hội với dung môi Ethanol ở các nồng độ khác nhau

bằng hệ thống Soxhlet ở thời gian 6h, tỉ lệ dung mơi/ngun liệu là 25:1 thì lượng cao Lô hội thu được cao nhất ở nồng độ 70% có khối lượng là 3.98 g (H = 39.8%) và lượng cao Lô hội giảm dần khi nồng độ Ethanol tăng, lượng cao thấp nhất là ở nồng độ 60% với khối lượng cao là 2.15 g (H = 21.5%). Do vậy ở nồng độ Ethanol 70% có khối lượng và hiệu suất cao nhất tối ưu nhất.

Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu:

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 41 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

Bảng 3. 3: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với Ethanol 70% ở các tỉ lệ khác nhau

Hình 3. 3: Biểu đồ ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội

Nhận xét: Nhận thấy khi thay đổi tỉ lệ dung mơi/ngun liệu thì khối lượng cũng

tăng nhưng tăng khơng đáng kể. Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đạt hiệu suất cao chiết cao nhất là 25:1.

Kết quả thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết

Bảng 3. 4: Khối lượng cao chiết vỏ lá Lô Hội với dung môi Ethanol 70% ở các khoảng thời gian khác nhau

Thời gian (h) Khối lượng cao

(g)

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 42 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu

Viện Kỹ Thuật - Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Nghiên Cứu Khoa Học

Hình 3. 4: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất cao chiết vỏ lá Lô Hội

Nhận xét: Khi tăng thời gian chiết thì khối lượng cao chiết có xu hướng giảm dẫn

đến hiệu suất chiết cũng giảm. Tuy nhiên, chiết ở khoảng thời gian 7h thì hiệu suất chiết đạt cao nhất là 37.3% tương đương với 3.73 g cao chiết. Như vậy lựa chọn thời gian chiết 7h cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.1. Kết quả định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết cao Lơ hội

Định tính thành phần dược liệu được thể hiện ở các bảng. Dấu (-) cho kết quả âm tính.

Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính.

HDKH: ThS. Vũ Thị Hồng Phượng Trang 43 Chủ nhiệm: Nguyễn Thanh Nguyên

Bảng 3. 5: Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao Ethyl AcetateNhóm chất Nhóm chất Anthranoid Steroid triterpenoid Alkaloid Flavonoid Saponin